Области использования иммунодиагностики.

Кафедра клинической иммунологии

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Учебное пособие для студентов 6 курса лечебного и педиатрического факультетов

 

Составил: доц. Сенникова Ю.А.

 

Новосибирск 2011

Содержание.

Предисловие……………………………………………………………….……………..2

Введение…………………………………………………………………………….…....3

1. Области использования иммунодиагностики…………………………………….....4

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы….…6

2.1. Количественное определение популяций лимфоцитов……….…………...…..8

2.1.1. Проточная цитометрия…………...………………………….…………….8

2.1.2. CD-классификация мембранных молекул иммунокомпетентных клеток……………………………………………………………………………………10

2.1.2. Маркеры активации лимфоцитов………………….…………………….10

2.2. Методы оценки функциональной активности лимфоцитов………………….12

2.2.1. Определение пролиферативной способности лимфоцитов……………12

2.2.2. Определение цитотоксической активности Т-лимфоцитов…...……...13

2.2.3. Оценка ГЗТ in vivo ……………………………………… ……………….13

2.2.4. Оценка цитотоксической активности естественных киллеров………..14

2.2.5. Методы количественного определения иммуноглобулинов………….14

2.3. Методы исследования функций фагоцитов........................................................16

2.3.1. Методы определения хемотаксиса лейкоцитов……………..…………..17

2.3.2. Определение адгезивных свойств…………………………..……………17

2.3.3. Определение фагоцитарной способности……………….………………18

2.3.4. Оценка бактерицидной активности………………………………………18

2.4. Методы оценки системы комплемента…………………………………………19

3. Иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело. ………20

3.1. Иммуноферментный анализ……………………………...…………………….21

3.2. Радиоиммунный анализ………………………………………………...……….22

3.3. Иммунофлюоресцентный анализ…………..…………………………………..22

4. Методы исследования цитокинов…………………………..………………………24

Заключение…………………………………………………………………………..….25Вопросы для самоконтроля ………………………………...………………………….25

Задания в тестовой форме……………………………………………………...………26

Словарь иммунологических терминов………………………………………………..29
Библиографический список…………………………………………………………....32

Предисловие.

Согласно определению ВОЗ клиническая иммунология – это клиническая и лабораторная дисциплина, занимающаяся изучением вопросов диагностики и лечения больных с различными заболеваниями и патологическими состояниями, в основе которых лежат иммунологические механизмы, а также состояниями, в терапии и профилактике которых иммуноактивные препараты играют ведущую роль. Обращает на себя внимание то, что иммунология – это и лабораторная дисциплина. Сложилось так, что иммунологические методы используются очень широко в различных областях медицины. Главным образом, это методы, основанные на иммунных реакциях (антиген+антитело, ГЗТ). Одной из задач клинической иммунологии в современной медицине является обогащение ее иммунологическими подходами к диагностике и лечению заболеваний.

Данное пособие адресовано студентам лечебного и педиатрического факультетов, изучающим клиническую иммунологию, в частности, при подготовке поразделу 2 «Оценка иммунного статуса. Иммунодиагностика», темы 2 «Методы оценки иммунного статуса и их клиническая интерпретация» учебно-методического плана. Пособие содержит развернутый систематизированный материал по данной теме, освещающий возможности современной иммунодиагностики, области использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины, методологию иммунодиагностики основных заболеваний иммунной системы, основные иммунологические методы. Настоящее учебное пособие будет способствовать формированию представлений о принципах иммунодиагностики; приобретению знаний о показаниях для исследования иммунного статуса, количественных и функциональных тестах оценки Т-клеточного, В-клеточного иммунитета, НК-клеток, фагоцитоза, комплемента и их клинического значение, умений определять показания для исследования иммунного статуса, интерпретировать основные показатели иммунного статуса.

Изучение данного вопроса предполагает преемственность и базируется на знаниях, приобретенных студентами на младших курсах при изучении смежных дисциплин (микробиология, общая биология, и др.). В то же время, полученные студентами знания могут быть востребованы при изучении целого ряда других клинических дисциплин образовательной программы (гематология, трансплантология, онкология, инфекционные болезни и др.).

Настоящее пособие посвящено 2 и 3 разделам рабочей программы по дисциплине “клиническая иммунология”.

 

Введение.

Впервые методология иммунодиагностики заболеваний иммунной системы была разработана в нашей стране Р.В. Петровым и соавторами, опубликовавшими в 1984 г. методические рекомендации «Оценка иммунного статуса человека». В соответствии с этими методическими рекомендациями все методы иммунодиагностики разделены на тесты I и II уровней. Тесты I уровня направлены на идентификацию грубых поломок иммунной системы, т.е. первичных иммунодефицитов; тесты II уровня – на углубленное изучение функционального состояния иммунной системы. К тестам I уровня относят:

– определение функциональной активности фагоцитов;

– определение численности основных популяций и субпопуляций лимфоцитов;

– определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови.

К тестам II уровня относятся:
– определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов;
– тест торможения миграции лейкоцитов с использованием в качестве стимулятора ФГА (фитогемагглютинина);
– оценка пролиферативной активности Т- и В- лимфоцитов на митогены, антигены, аллогенные клетки;
– оценка активности киллерных лимфоцитов;
– выявление циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК);
– определение различных компонентов комплемента;
– оценка различных этапов фагоцитоза и рецепторного аппарата фагоцитов;
– тесты по определению медиаторов иммунной системы, в том числе продукции и рецепции интерлейкинов;
– анализ генов, ответственных за экспрессию иммунологически значимых молекул.

В пособии приведены современные принципы оценки состояния основных звеньев иммунной системы человека для диагностики нарушений иммунной системы при иммунопатологических состояниях. Представлен краткий обзор современных лабораторных методов, используемых в иммунологии. Также охарактеризованы возможности использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины.

 

Области использования иммунодиагностики.

Представляем данные об использовании иммунологических методов в разных областях медицины. Современная диагностика любого инфекционного заболевания основывается на обнаружении возбудителя болезни (бактериологические методы, ПЦР) или на выявлении специфического иммунного ответа на возбудителя (антитела, ГЗТ). Так, в диагностике ВИЧ-инфекции выявление антител с помощью ИФА является скрининговым методом, а подтверждающим – иммуноблотинг, позволяющий идентифицировать антитела к различным антигенам вируса. Все вирусные, многие бактериальные инфекции диагностируют путем выявления специфических антител (IgM и IgG) к поверхностным антигенам микроорганизмов. ГЗТ чаще оценивают in vivо, например, в диагностике туберкулеза.

Эндокринология, гематология и другие области внутренней медицины широко используют иммунологические методы в диагностике.

Верификация опухолевого клона в диагностике онкологических и онкогематологических заболеваний проводится морфологическими методами («золотой» стандарт) и путем фенотипирования опухолевых клеток. Иммунофенотипирование клеток – это определение поверхностных маркёров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Традиционные морфологические и цитохимические исследования клеток субстрата болезни (кровь, красный костный мозг, лимфатические узлы, селезёнка и т.д.) во многих случаях, особенно при лимфопролиферативных заболеваниях, не позволяют выявить всё многообразие вариантов среди морфологически сходных форм и установить источник происхождения патологического клона. Эти задачи могут быть решены только путём изучения иммунологической характеристики клеток. При неопластических изменениях блок дифференцировки может произойти на любой стадии нормального развития клеток, в результате чего образуется клон патологических клеток, определяющих субстрат болезни и имеющих одинаковую иммунологическую (или фенотипическую) характеристику. Проведя исследования этих маркёров на клетках, можно определить, какой форме и варианту заболевания они соответствуют, то есть на основе иммунологического фенотипа клеток проводить дифференциальную диагностику, которая наиболее трудна при лимфопролиферативных заболеваниях, потому что основной клеткой патологического субстрата болезни являются морфологически почти однотипные клетки. В диагностике минимальной резидуальной болезни (МРБ) могут использоваться иммунологические методы, в частности, иммунофенотипирование методом проточной цитометрии. Минимальной резидуальной или минимальной остаточной болезнью называют небольшую популяцию опухолевых клеток, которая не может быть зафиксирована с помощью морфологических методов, но обнаруживается более тонкими методами исследования, выявляющими 0,03%- 0,5% клеток аберрантного фенотипа.

Определение концентрации различных биологически-активных веществ: гормонов, онкофетальных антигенов, витаминов и других молекул, не определяемых стандартными биохимическими методами, может осуществляться только на основе иммунологических методов (главным образом, ИФА).

 

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы.

Для объективной оценки состояния иммунной системы человека введено понятие об иммунном статусе. Иммунный статус – это комплекс показателей, характеризующих субпопуляционный состав лимфоцитов, гуморальный и клеточный иммунитет, фагоцитарное звено, то есть практически всю иммунную систему человека в данный момент времени. Исследование иммунного статуса проводится с целью уточнения диагноза, определения тактики лечения и прогноза при первичных иммунодефицитах, ВИЧ-инфекции и других вторичных иммунодефицитах, аутоиммунных, аллергических заболеваниях.

Иммунодиагностика предполагает идентификацию нарушенного звена иммунной системы, индивидуальна для данного заболевания у конкретного больного. Наибольшее значение иммунодиагностика имеет при иммунодефицитах. При аутоиммунных заболеваниях иммунологические методы применяются для подтверждения клинического диагноза: например определение аутоантител. При аллергических заболеваниях иммунодиагностика позволяет выявить причинный аллерген и определяет возможности аллерген-специфической иммунотерапии. Дальнейшее изучение дисциплины, а именно частных вопросов иммунопатологии, предполагает анализ результатов исследования иммунного статуса для постановки диагноза и показаний к терапии.

Для оценки иммунной системы человека рекомендованы следующие основные методы (ВОЗ, 1993):

1. Т-лимфоциты

– определение субпопуляций

– оценка пролиферации in vitro на митогены

– оценка цитотоксичности

– оценка эффекторов ГЗТ

– кожные тесты с микробными АГ in vivo

2. В-лимфоциты

– определение количества В-клеток

– иммуноглобулины, субклассы

– иммунные комплексы

– оценка пролиферации in vitro

– оценка продукции АТ разной специфичности

3. Моноциты/макрофаги

– фагоцитоз

– хемотаксис

– адгезия

4. Неспецифические факторы защиты

– компоненты системы комплемента

– белки острой фазы

5. Цитокины

– определение концентрации цитокинов в сыворотке

– определение растворимых рецепторов цитокинов

– определение внутриклеточных цитокинов.

Далее приведены основные иммунологические методы, используемые для оценки иммунной системы человека.

Основными объектами для иммунологического обследования являются иммунокомпетентные клетки (Т-, В, NK-лимфоциты, моноциты),получаемые из периферической крови, а также регуляторные и эффекторные молекулы (цитокины, комплемент и др.) из сыворотки (плазмы) крови. В некоторых случаях исследуются иммунокомпетентные клетки и регуляторные молекулы из тканей и различных биологических жидкостей.

 

 

2.1. Количественное определение популяций лимфоцитов.

2.1.1. Проточная цитометрия.

Определение содержания основных популяций лимфоцитов (морфологически представляющие собой единообразные клетки) основано на выявлении поверхностных антигенов (дифференцировочных антигенов).

В настоящее время для определения поверхностных антигенов лимфоцитов (иммунофенотипирование) применяются моноклональные антитела, меченные флюорохромом, и проточный цитофлюориметр.

Метод получения моноклональных антител (МАТ), который предложили в 1975 г. Георг Келер и Цезарь Мильштейн, быстро стал одной из ключевых иммунологических технологий. Путем слияния нормальных активированных антителопродуцирующих В-лимфоцитов и миеломных клеток (плазматических опухолевых клеток) образована гибридная клетка, названная гибридомой, которая обладает способностью неограниченного роста миеломной клетки и секретирует антитела как В-клетка. Значение работы Келера и Мильштейна было признано Нобелевской премией (1984 г.)

Логика получения моноклональных анител проста: необходимо изолировать единственную антителопродуцирующую клетку, обеспечив ее длительное размножение и функционирование. Проблему решает гибридома – соматический гибрид между В-лимфоцитами и опухолевыми клетками. Получение гибридом сводится к следующему. Мышей иммунизируют антигеном. Через несколько дней, когда в лимфоидной ткани накапливаются активированные лимфоциты, из селезенки готовят взвесь клеток, которые используют для гибридизации. Спленоциты смешивают с миеломными клетками в присутствии агента, способствующего слиянию клеточных мембран. Отбирают «успешные» клеточные гибриды, которые секретируют антитела требуемой специфичности. Размножаясь, они дают начало «бессмертным» клонам, продуцирующим моноколональные антитела.

Моноклональные антитела используются не только для выявления разных типов клеток, но и для изучения процессов дифференцировки, созревания, межклеточного взаимодействия и активации лимфоцитов. Проточный цитофлюориметр – прибор, позволяющий быстро оценить состав клеточной популяции по флюоресценции и оптическим характеристикам клеток. С помощью этого прибора можно определить абсолютное и относительное число клеток разных популяций и субпопуляций. К основным преимуществам метода относятся быстрота анализа и возможность одновременной оценки многих параметров клетки: размера, оптической плотности, поверхностных антигенов. Результаты исследования выражают в виде абсолютного и относительного числа лимфоцитов разных популяций. Оценку результатов проводят с учетом нормальных показателей, которые зависят от возраста, пола и расы. Простой способ проверки надежности результатов заключается в том, что относительное содержание основных популяций лимфоцитов (Т, В и НК-лимфоцитов) в сумме должно составлять 100%. В норме у взрослых около 70% лимфоцитов крови составляют Т-лимфоциты, при этом соотношение лимфоцитов CD4/CD8 превышает 1, как правило, оно составляет 1,5–2,0 остальные 30% приходятся на В- и НК-лимфоциты.

Метод применяется для определения субпопуляций лимфоцитов (например, содержание лимфоцитов CD 4 при ВИЧ-инфекции), оценки функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (фагоцитарная активность, определение внутриклеточных цитокинов). Этот метод применяется также для выявления других изменений клеточного состава крови и определения активированных лимфоцитов, определения антигенов гистосовместимости. Проточная цитофлюориметрия применяется также для анализа ДНК при исследовании клеточного цикла. Проточная цитофлюориметрия является стандартным методом диагностики гемобластозов, поскольку позволяет определить тип и стадию дифференцировки трансформированных клеток. В онкологии метод находит применение, в частности, для определения специфических маркеров.