Идентификация в лаборатории производится на автоматической системе для идентификации микроорганизмов системы VITEK. Одним из последних достижений мировой науки является внедрение в медицинскую лабораторную практику метода масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия обеспечивает высокую производительность и практически 100% специфичность и чувствительность, а также непревзойденную скорость анализа. Масс-спектрометрия - метод идентификации молекул путем измерения отношения их массы к заряду (m/z) в ионизированном состоянии. MALDI (MatrixAssistedLaserDesorption'Ionization) - ионизация вещества с помощью матрицы и лазерного излучения. TOF MS (Time Of Flight Mass-Spectrometry) – время пролетная масс-спектрометрия. Масса молекулы оценивается по времени пролета от источника ионизации до детектора. Для идентификации бактерий Vitek MS(Рис.12) (MALDI-TOF) определяет спектр белков напрямую из бактериальной клетки без предварительной длительной пробоподготовки. Для каждого вида микроорганизмов сформирован характерный набор белков (био маркеров), полученный на основе анализа не менее 50 масс-спектров этого вида. При этом образцы получены из различных источников (больниц, лабораторий, микробиологических коллекций), а каждый образец тщательно идентифицирован с помощью сиквенса 16s РНК или других сертифицированных методов анализа. Структурированная таким образом база данных позволяет быстро и точно идентифицировать микробиологические штаммы.
Рис.9 Постановка слайдов на Vitek MS
Вся методика идентификации на Vitek MS (MALDI-TOF) состоит из 3-х этапов:
Этап 1: Внесение данных (сканирование номера на рабочей станции)
Этап 2: Подготовка образца. Анализ начинается с того, что на подложке масс-спектрометра (одноразовые слайды с уникальным штрих-кодом позволяют избежать внесения данных вручную, что ускоряет рабочие потоки на независимых рабочих станциях)(Рис.18)смешивают биоматериал из колонии бактерий и специальную матрицу (2',5' дигидроксибензойная кислота), раствор уже готов к использованию и устойчив к свету). Затраты по времени для подготовки 24 изолятов - 10 минут, для 96 изолятов - 33 минуты.Обязательное нанесения контроля в центральную лунку.
Этап 3: Идентификация. После этого образец помещают в прибор и подвергают воздействию наносекундных лазерных импульсов. При этом молекулы матрицы и аналита (в частности, белки) переходят в газовую фазу, а протонированные молекулы матрицы взаимодействуют с белками, перенося на них положительный заряд. Под действием электрического поля ионизированные белки движутся от источника ионизации к детектору с ускорениями, обратно пропорциональными их атомным массам. Программное обеспечение прибора оценивает время пролета частиц и преобразует эту информацию в спектр молекулярных масс (масс-спектр). Масс-спектр сравнивается со спектрами из базы данных, и на основании сведений о массах характеристических белков происходит идентификация микроорганизмов. Затраты по времени для идентификации 24 изолятов - 12 минут, для 96 изолятов - 43 минуты.
Таким образом, на идентификацию одного микроорганизма требуется меньше 2-х минут времени, при этом образцом может служить первичная колония!
| Название процесса | Возможность автоматизации |
| Внесение данных | автоматизировано |
| Подготовка образца | ручной метод |
| Идентификация микроорганизмов | автоматизировано |
| Соединение с ЛИС | автоматизировано |
| Выдача результатов | автоматизировано |
Таблица 4. Автоматизация Vitek MS
База данных Vitek MS состоит из 755 клинически значимых видов (бактерий, дрожжей, плесневых грибов/ дерматофитов, микобактерий) и покрывает большинство видов, встречающихся в ежедневной практике микробиологической лаборатории, и эта база постоянно пополняется.
Главные преимущества анализатора Vitek MS:
· Заменяет стандартные биохимические методы
· Достоверный результат за две минуты
· Высокая воспроизводимость анализа
· Значительная экономия средств (стоимость 1 исследования складывается из стоимости одноразовых планшет и матрикса)
· Оптимизированная загрузка образцов: просто нанесите микроорганизмы на слайд, добавьте матрикс и запустите анализ.
При идентификации микроорганизмов необходимо работать только с чистой культурой, поскольку присутствие посторонних микроорганизмов может исказить результаты исследования и послужить поводом для ошибочного заключения.
Выводы:
· Процедура идентификации стандартизирована;
· Максимальный уровень автоматизации;
· Сканирование номера слайда уменьшает количество ошибок;
· Заменяет стандартные биохимические методы;
· Проводит идентификацию без предварительной длительной пробоподготовки;
· Одноразовые слайды исключают риск контаминации;
· Результаты исследований в рекордно короткие сроки;
· Повышает безопасность лабораторного техника.
Для идентификации бактерий аппарат определяет спектр белков напрямую из бактериальной клетки без предварительной длительной пробоподготовки. Для каждого вида микроорганизмов сформирован характерный набор белков (биомаркеров), полученный на основе анализа не менее 50 масс-спектров этого вида. При этом образцы получены из различных источников (больниц, лабораторий, микробиологических коллекций), а каждый образец тщательно идентифицирован с помощью сиквенса 16s РНК или других сертифицированных методов анализа. Структурированная таким образом база данных позволяет быстро и точно идентифицировать микробиологические штаммы.
Анализ начинается с того, что на подложке масс-спектрометра смешивают биоматериал из колонии бактерий и специальную матрицу.
Рис.10. Подложка масс-спектрометра
После этого образец помещают в прибор и подвергают воздействию наносекундных лазерных импульсов. При этом молекулы матрицы и аналита (в частности, белки) переходят в газовую фазу, а протонированные молекулы матрицы взаимодействуют с белками, перенося на них положительный заряд. Под действием электрического поля ионизированные белки движутся от источника ионизации к детектору с ускорениями, обратно пропорциональными их атомным массам. Программное обеспечение прибора оценивает время пролета частиц и преобразует эту информацию в спектр молекулярных масс (масс-спектр). Масс-спектр сравнивается со спектрами из базы данных, и на основании сведений о массах характеристических белков происходит идентификация микроорганизмов. Затраты по времени для идентификации 24 изолятов - 12 минут, для 96 изолятов - 43 минуты.
Рис.11. Масс-спектрометр
Таким образом, на идентификацию одного микроорганизма требуется меньше 2-х минут времени, при этом образцом может служить первичная колония. А это означает то, что подобный метод существенно упрощает и ускоряет процесс идентификации микроорганизма.
