Морфофункциональная оценка тромбоцитов с помощью фазово- интерференционной микроскопии.

Прототип - оценка функциональной полноценности концентрата живых тромбоцитов с помощью метода витальной компьютерной морфометрии на основе отечественного фазово-интерференционного микроскопа «Цитоскан». Из локтевой вены осуществляют забор крови в объеме 1,0 мл в стандартную пробирку из ареактивного пластика с антикоагулянтом (ЭДТА). Исследуют тромбоциты в капле плазмы, обогащенной тромбоцитами, для получения которой кровь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут. Алгоритм морфометрии обеспечивает автоматическое определение заданных размерных параметров отдельных клеток (диаметр, периметр, высота, площадь, объем), подсчет процента активированных тромбоцитов, статистическую обработку данных на популяционном уровне и документирование результатов в виде цитограмм. Уровень функциональной активности тромбоцитов определяли на основании подсчета различных морфологических типов. Подавляющее большинство тромбоцитов представлено плоскими, округлыми клетками с гладкой или складчатой поверхностью - «гладкие» и «рифленые» дискоциты, идентифицируемые как клетки «покоя» (1-й морфологический тип). Ко 2-му типу тромбоцитов были отнесены дискоидные клетки округлой, неправильной формы с гладкой или складчатой поверхностью и одним-тремя короткими (меньше диаметра клетки) отростками-псевдоподиями, являющимися выростами поверхностной мембраны - тромбоциты с низким уровнем активности. Клетки, имеющие от двух до пяти длинных (больше диаметра клетки) отростков-«антенн», отнесены к 3-му типу и отличались большим многообразием форм: от плоских дисков до неправильной причудливой формы - высокоактивированные тромбоциты. Тромбоциты неправильной формы с неровной бугристой поверхностью, большим количеством отростков различной длины и многочисленными вакуолями были отнесены к 4-му морфологическому типу - дегенеративно-измененным клеткам, практически исчерпавшим свой функциональный резерв. Распределение морфологических типов клеток в концентрате тромбоцитов (КТ) оказалось 56,7%; 26,2%; 14,1%; 3,0%. В крови соматически здоровых людей соотношение морфологических типов клеток составляет - 64, 21, 12 и 3% соответственно. Метод позволяет исследовать живые нативные тромбоциты, не подвергавшихся предварительной обработке или фиксации.

Недостатками данного метода являются: необходимость получения плазмы, богатой тромбоцитами; предлагаемый алгоритм морфометрии клеток (диаметр, периметр, высота, площадь, объем) не позволяет оценить целостность внутреннего состава исследуемых тромбоцитов; отсутствие адекватного анализа высокой и низкой функциональной активностью среди дисковидных тромбоцитов; использование дорогостоящей уникальной микроскопической аппаратуры. Итак, предлагаемый биофизический метод не отражает структурно-функциональную целостность тромбоцитов. Следовательно, для оценки клетки как единого целого необходимо использовать методы, витального окрашивания тромбоцитов, позволяющие оценить функциональную активность живых клеток.

Значительную часть цитоплазмы тромбоцита составляют везикулы (гранулы) с различными секреторными веществами. При различных заболеваниях увеличивается доля тромбоцитов, не содержащих гранул: такие клетки обладают сниженной функциональной активностью или являются дегенеративными. Следовательно, наличие в тромбоците гранул, а также их количество можно рассматривать в качестве критериев жизнеспособности и функциональной активности клеток. Известно, что часть тромбоцитарных гранул обладает сродством к акридиновым красителям - в частности, к акридиновому оранжевому. Флуорохром акридиновый оранжевый (АО) широко используется в клеточной биологии, в том числе и для прижизненных исследований. Другой акридиновый краситель - трипафлавин - обладает способностью прижизненно окрашивать мембранные компоненты клеток, т.е. с помощью этого флуорохрома возможно окрасить цитоплазму нефиксированных тромбоцитов. Таким образом, имеются весомые основания полагать, что прижизненный краситель на основе этих флуорохромов (трипафлавина и АО) позволит выявить цитоплазму нефиксированных тромбоцитов и гранулы в их составе. Для дифференциального прижизненного окрашивания тромбоцитов предложен краситель, изготовленный на основе 2-х флуорохромов - трипафлавина и акридинового оранжевого. В нефиксированных тромбоцитах после окрашивания отчетливо выявляются гранулы, имеющие характерное красное свечение во флуоресцентном микроскопе, при этом контуры тромбоцитов четко различимы. Прижизненную окраску тромбоцитов можно производить как в пробирке, так и на предметном стекле. Тромбоциты крови, плазма обогащенная тромбоцитами, тромбоконцентрат заготавливали на соответствующем антикоагулянте.

В пробирке смешивают 10-20 мкл анализируемого образца и 10-20 мкл рабочего раствора красителя. Окрашивание проводят в течение 5-10 минут. Затем пипеткой отбирают 10-15 мкл смеси, переносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Оценку прижизненно окрашенных тромбоцитов проводят с помощью флуоресцентного микроскопа (объектив ×100, числовая апертура 1.25, λ возбуждения 450-490 нм, λ эмиссии - от 520 нм) в полуавтоматическом режиме. С помощью цифровой фотокамеры при экспозиции 0.25-0.5 сек получают цифровые изображения тромбоцитов и переносят в компьютер. Для морфометрического исследования тромбоцитов используют программу Adobe Photoshop. Анализ характера и интенсивности свечения прижизненно окрашенных тромбоцитов можно наблюдать в течение длительного времени (24-48 часов). При этом среди пула анализируемых тромбоцитов отчетливо выявляются клетки с гранулами и клетки без гранул (рисунок 1. Обозначения: А) клетки без гранул; Б) клетка содержат 2 гранулы; В) клетки содержат от 3 до 7 гранул; Г) клетки содержат более 10 гранул). Подчеркнем, что интенсивность свечения тромбоцитов зависит от количества в них гранул и существенно выше интенсивности свечения клеток без гранул.Тромбоциты с гранулами содержат от 3 до 15 визуально различимых везикул диаметром 300-600 нм, которые распределены по всему объему клетки и интенсивно окрашиваются также на Са²⁺ и серотонин. Тромбоциты без гранул не содержат везикул диаметром 300-600 нм или содержат 1-2 меньших размеров гранулы, которые всегда связаны с клеточной оболочкой и практически не окрашиваются на Са²⁺ и серотонин. Тромбоциты, прижизненно окрашенные трипафлавином и акридиновым оранжевым, сохраняют свою адгезивную и агрегационную активность, которая зависит от количества тромбоцитов, содержащих более 3 гранул (таблица 4). Кроме того, в экспериментах показано, что как неокрашенные, так и окрашенные флуохромами тромбоциты после их активации кальцием проявляют ростстимулирующее действие в культуре фибробластов человека.

Таким образом, прижизненно окрашенные трипафлавином и акридиновым оранжевым тромбоциты человека полностью сохраняют свою функциональную активность. Результаты этих исследований обосновывают возможность оценки морфофункциональной активности этих клеток.

Установлено, что прижизненно окрашенные тромбоциты после воздействия индуктором агрегации (коллаген) образуют тесное скопление клеток (агрегатов), которые не содержат гранул (рис 2.). Следовательно, отсутствие или уменьшение количества тромбоцитов с гранулами указывает на прошедший процесс активирования клеток в анализируемой популяции. Эти клетки либо потеряли, либо снизили свой функциональный потенциал. Клиническая эффективность трансфузии такой популяции тромбоцитов для коррекции система гемостаза у больных не высока или отсутствует. С другой стороны, выявление популяции тромбоцитов без или с повышенным количеством гранул в крови имеет большое диагностическое значение. Такая информация указывает на активацию (возможность тромбообразования) или подавления (возможность кровотечения) системы гемостаза и обосновывает необходимость проведения соответствующей коррекции у больного.[3]