Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. Примером такого свечения являются известные всем лампы дневного света, в которых в результате облучения ультрафиолетовыми лучами светится специальный состав - люминофор, покрывающий изнутри колбу лампы.

Цвет люминесценции обычно смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом. Так, если люминесценция возбуждается синим светом, то цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается невидимым ультрафиолетовым излучением, то цвет ее может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.

Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от обычного светового микроскопа в основном следующим:

1. Наличие мощного источника света в осветителе, излучающего преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления). В специальных люминесцентных осветителях, которые устанавливают на обычный микроскоп, применяют кварцевые галогенные лампы (КГМ).

2. Наличие системы светофильтров: а) возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию;

б) теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику люминесцентного микроскопа. В отечественных люминесцентных микроскопах теплозащитную функцию кроме того выполняет кювета с плоскопараллельными стеклами, заполненная дистиллированной водой. Эта кювета установлена непосредственно после коллектора.

При работе с люминесцентным микроскопом надо обращать особое внимание на то, чтобы эта кювета была полностью заполнена водой и чтобы вода была абсолютно чистой и прозрачной, поскольку при длительной работе микроскопа в воде могут размножаться микроорганизмы и она мутнеет;

в) "запирающие" светофильтры расположены между препаратом и окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.

В нашей стране разработан очень эффективный способ освещения препаратов для возбуждения люминесценции, который используется во всех отечественных люминесцентных микроскопах. Этот способ заключается в том, что препарат освещают светом, падающим на него через объектив. Благодаря этому освещенность увеличивается при использовании объектов, имеющих большую числовую апертуру, т. е. тех, которые используются для изучения микроорганизмов. Очень важную роль при этом способе освещения играет специальная интерференционная светоделительная пластинка, направляющая свет в объектив и представляющая собой полупрозрачное зеркало, которое избирательно отражает и направляет в объектив только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию, а пропускает в окуляр только свет люминесценции.

Оптика объективов люминесцентного микроскопа изготавливается из нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. На оправе таких объективов выгравирована буква "Л". При работе с объективами масляной иммерсии при люминесцентной микроскопии пользуются специальным нелюминесцирующим иммерсионным маслом.

Правила настройки люминесцентного микроскопа подробно изложены в инструкции к микроскопу.

На рис. 3 показан люминесцентный микроскоп "Люмам", выпускаемый Ленинградским оптико-механическим объединением (ЛОМО).

Рис. 3. Микроскоп люминесцентный исследовательский серии 'Люмам ИЗ'

Для изучения микроорганизмов в люминесцентном микроскопе их предварительно окрашивают (флюорохромируют) сильно разведенными растворами специальных люминесцирующих красителей (флюорохромов), которые избирательно связываются с определенными структурами клетки. Флюорохромы отличаются от обычных красителей тем, что применяются в очень малых концентрациях (До нескольких мкг/мл); кроме того, ими могут быть окрашены не только фиксированные, но и живые клетки. Люминесцентная микроскопия также используется для регистрации результатов реакции иммунофлюоресценции (РИФ) (см. главу 12).

Электронная микроскопия

Различные способы световой микроскопии позволяют изучать сравнительно крупные микроорганизмы (бактерии, простейшие), но не дают возможности наблюдать объекты, величина которых меньше чем 0,2 мкм, так как разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны видимого света. Поэтому в световом микроскопе не может быть изучено строение вирусов.

Принципиально новые возможности для изучения тонкого строения бактерий и вирусов появились после изобретения электронного микроскопа.

В электронном микроскопе вместо световых волн для построения изображения используют поток электронов в глубоком вакууме.

В качестве "линз", фокусирующих электроны, служит электромагнитное поле, создаваемое электромагнитными катушками. Изображение в электронном микроскопе наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. Объекты при электронной микроскопии находятся также в глубоком вакууме, поэтому подвергаются фиксации и специальной обработке. Кроме того, они должны быть очень тонкими, так как поток электронов сильно поглощается. В связи с этим в качестве объектов используют ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм, что значительно меньше толщины вирусных частиц. Разрешающая способность современных электронных микроскопов равна 0,15 нм, что позволяет получить полезное увеличение в миллионы раз.

Электронный микроскоп по своим размерам и сложности устройства очень отличается от светового. Колонна микроскопа, в которой находится объект и разгоняются электроны, превышает рост человека, а для размещения микроскопа нужна отдельная комната.

Контрольные вопросы

1. Из каких основных частей состоит микроскоп?

2. Как правильно настроить свет в микроскопе?

3. В чем принцип фазово-контрастной микроскопии?

4. На чем основана темнопольная микроскопия и когда ее используют?

5. На чем основана люминесцентная микроскопия?

6. Что такое электронный микроскоп и какова его разрешающая способность (увеличение)?