Свойства воды гидратной оболочки

а) Температура кипения выше 100⁰С.

б) Температура замерзания ниже 0^ОС.

в) В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества.

г) Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок.

При удалении гидратной оболочки белков происходит к оагуляция, т.е. склеивание белковых частиц и выпадение их в осадок. Для этого достаточно изменить структуру частицы белка, так, чтобы ее гидрофильные группы, которые связывают воду растворителя, оказались внутри частицы.

2) ЗАРЯД БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ. На поверхности белковой молекулы имеются как положительно, так и отрицательно заряженные ра­дикалы аминокислот. Количество этих групп, а следовательно, и сум­марный заряд белков зависят от рН среды. Значение рН, при котором белок имеет суммарный нулевой заряд, называется изоэлектрической точ­кой (ИЭТ). В ИЭТ количество положительно и отрицатель­но заряженных групп одинаково, т.е. белок нахо­дится в изоэлектрическом состоянии. Величина заряда белков — один из факторов, уве­личивающий их растворимость. При потере заряда в изоэлектрической точке белки легче агрегируют и выпадают в осадок. Это особенно характерно для де­натурированных белков, у которых на поверхности появляются гидрофобные радикалы аминокислот.

Реакции осаждения балка в растворе делятся на две группы: обратимые (высаливание) и необратимые (денатурация).

ДЕНАТУРАЦИЯ белков — это разрушение их нативной конформации, вызванное разрывом слабых связей, ста­билизирующих пространственные структуры, при дей­ствии денатурирующих агентов. Денатурация сопро­вождается потерей биологической активности белка.

1. Уникальная трехмерная структура каждого белка разрушается, и все молекулы одного белка приобретают случайную конформацию, т.е. отлич­ную от других таких же молекул.

2. Радикалы аминокислот, формирующие ак­тивный центр белка, оказываются пространст­венно удаленными друг от друга, т.е. разруша­ется специфический центр связывания белка с лигандом.

3. Гидрофобные радикалы, обычно находящиеся в гидрофобном ядре глобулярных белков, при де­натурации оказываются на поверхности молекулы, тем самым создаются условия для агрегации бел­ков. Агрегаты белков выпадают в осадок. При денатурации белков не происходит разру­шения их первичной структуры.

ФАКТОРЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ ДЕНАТУРАЦИЮ БЕЛКОВ

Факторы, которые вызывают денатурацию белков, можно разделить на физические и химические.

Физические факторы

1. Высокие температуры. Для разных белков характерна различная чувствительность к тепловому воздействию. Часть белков подвергается денатурации уже при 40-50⁰С. Такие белки называют термолабильными. Другие белки денатурируют при гораздо более высоких температурах, они являются термостабильными.

2. Ультрафиолетовое облучение

3. Рентгеновское и радиоактивное облучение

4. Ультразвук

5. Механическое воздействие (например, вибрация).

Химические факторы

1. Концентрированные кислоты и щелочи. Например, трихлоруксусная кислота (органическая), азотная кислота (неорганическая).

2. Соли тяжелых металлов (например, CuSO₄).

3. Органические растворители (этиловый спирт, ацетон)

4. Растительные алкалоиды.

5. Мочевина в высоких концентрациях

6. Другие вещества, способные нарушать слабые типы связей в молекулах белков.

Воздействие факторами денатурации применяют для стерилизации оборудования и инструментов, а также как антисептики (фенол и его производные), лекарственные препараты (например, березовый деготь входит в состав мази Вишневского, ляпис, коллоидное серебро – колларгол)

Обратимость денатурации

Удаление денатурирующих агентов диализом приводит к восстановлению конформации и функ­ции белка, т.е. к ренативации (ренатурации).

В пробирке (in vitro) чаще всего это – необратимый процесс. Если же денатурированный белок поместить в условия, близкие к нативным, то он может ренатурировать, но очень медленно, и такое явление характерно не для всех белков.

In vivo, в организме возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» структуру денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренатурации. Такие специфические белки известны как «шапероны».

Белки — ша­пероны обладают способностью связы­ваться с частично денатурированными, находя­щимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии белками и восстанавливать их нативную конформацию. Шапероны образуют комплекс, внутри которого находится полость. Белок, имеющий на своей поверхности фрагменты, обогащенные гидрофобными аминокислот­ными остатками, попадает в полость шаперонинового комплекса. В этой поло­сти в условиях изолированности от других молекул цитозоля клетки выбор возможных конформаций белка происходит до тех пор, пока не будет найдена энергетически наиболее выгодная конформация. Шаперонзависимое формирование нативной конформаций связано с расходованием значитель­ного количества энергии, источником которой служит АТР.

Классификации белков

Удовлетворительной универсальной классификации белков пока нет. Существующие классификации зачастую противоречат друг другу и имеют ограниченную ценность. Существуют системы классификации белков, основанные на их растворимости, конформации, химическому строению, по функциям.

По растворимости. Введена в 1907-1908 гг. Продолжает использоваться и до настоящего времени. Согласно этой классификации белки делятся на водорастворимые (альбумины), солерастворимые (глобулины), спирторастворимые (проламины) и нерастворимые (склеропротеины). Однако строго установленных границ между группами белков не существует.

По конформационной структуре: фибриллярные, глобулярные и мембраносвязанные. Примером мембраносвязанного белка является калий, натрий – АТФза.

По химическому строению: простые белки или протеины – состоят только из аминокислот, сложные белки - протеиды – помимо аминокислот имеют в составе небелковую часть (углеводы, липиды, металлы, нуклеиновые кислоты).

К простым белкам относятся: альбумины, глобулины, гистоны, протамины, склеропротеины (коллагены) и т.д.

Альбумины составляют большую часть белков плазмы крови. Благодаря высокому содержанию дикарбоновых аминокислот альбумины удерживают катионы и играют основную роль в сохранении коллоидно-осмотического давления. Также альбумины транспортируют некоторые гидрофобные метаболиты и лекарственные средства.

Глобулины – гетерогенная сложная смесь белковых молекул с большой молекулярной массой. Выполняют транспортную, защитную и другие функции. Глобулины часто содержат углеводную часть.

Гистоны – низкомолекулярные белки с высоким содержанием аргинина и лизина. Входят в состав хроматина.

Протамины – белки с очень большим содержанием аргинина. Образуют комплексы с ДНК, выступают как регуляторные и репрессорные белки.

Склеропротеины (коллагены) – фибриллярные белки. Пептидная цепь коллагена содержит около 1000 аминокислотных остатков, из которых каждая третья аминокислота – глицин, 20% составляют пролин и гидроксипролин, 10% аланин, 40% - остальные аминокислоты. Основная функция – структурный белок.

Сложные белки состоят из белковой части (апопротеин) и небелковой части (простетическая группа) и называются холопротеинами. К сложным белкам относятся:

1)Нуклеопротеиды – простетическая группа – нуклеиновые кислоты. Среди многочисленных классов нуклеопротеидов наиболее изученными являются рибосомы, состоящие из нескольких молекул РНК и рибосомных белков, и хроматин – основной нуклеопротеид эукариотических клеток, состоящий из ДНК и структурообразующих белков – гистонов.

2)Гемопротеиды - небелковый компонент этих протеидов – гем, построен из четырех пиррольных колец, с ними связан ион двухвалентного железа (через атомы азота). К таким белкам относятся: гемоглобин, миоглобин, цитохромы. Этот класс белков еще называют хромопротеиды, поскольку гем является окрашенным соединением. Функции гемоглобин – транспорт кислорода, функция миоглобина – запасание кислорода в мышцах. Функции цитохромов (ферменты) – катализ окислительно-восстановаительных реакций и электронный транспорт в дыхательной цепи.

3) Металлопротеиды – в состав простетической группы входят металлы. Примеры: цитохром а – содержит медь.

4) Липопротеиды – содержат липиды (триацилглицериды, фосфолипиды, холестерол)

5) Фосфопротеиды – содержат остаток фосфорной кислоты

6) Глюкопротеиды – содержат сахара (нейтральные сахара, аминосахара, кислые производные моносахаридов);

Функции белков (рис.5)

В любом живом организме содержатся тысячи белков, выполняющих разнообразные функции (рис). Чтобы дать представление о многообразии белков, на схеме с увеличением примерно 1 х 1500000 приведен общий вид молекул (с соблюдением формы и размера) ряда вне- и внутриклеточных белков. Функции, выполняемые белками, распределяются примерно следующим образом.

Структурообразующие функции. Структурные белки отвечают за поддержание формы и стабильности клеток и тканей. В качестве примера структурного белка на схеме представлен фрагмент молекулы коллагена. В заданном масштабе целая молекула коллагена размером 1500000 • 300 нм заняла бы три страницы. К структурным белкам можно отнести также гистоны, функцией которых является организация укладки ДНК в хроматине. Структурные единицы хроматина, нуклеосомы, состоят из октамерного комплекса гистонов, на который навита молекула ДНК (DNA).

 

Рис. 5

Транспортные функции. Наиболее известным транспортным белком является гемоглобин эритроцитов (слева внизу), ответственный за перенос кислорода и диоксида углерода между легкими и тканями. В плазме крови содержатся множество других белков, выполняющих транспортные функции. Так, преальбумин переносит гормоны щитовидной железы — тироксин и трииодтиронин, трансферрин переносит железо. Ионные каналы и другие интегральные мембранные белки осуществляют транспорт ионов и метаболитов через биологические мембраны.

Защитные функции. Иммунная система защищает организм от возбудителей болезней и чужеродных веществ. В качестве ключевого компонента этой системы здесь представлен иммуноглобулин G, который на эритроцитах образует комплекс с мембранными гликолипидами.

Регуляторные функции. В биохимических сигнальных цепях белки осуществляют функции сигнальных веществ (гормонов) и гормональных рецепторов. В качестве примера здесь представлен комплекс гормона роста соматотропина с соответствующим рецептором. При этом внеклеточные (экстрацеллюлярные) домены двух молекул рецептора связывают одну молекулу гормона. Связывание с рецептором активирует цитоплазматические домены комплекса и тем самым обеспечивает дальнейшую передачу сигнала. В регуляции обмена веществ и процессов дифференцировки принимают решающее участие ДНК-ассоцированиые белки (факторы транскрипции).

Катализ. Среди белков наиболее многочисленную группу составляют ферменты. Самые низкомолекулярные из них имеют мол. массу 10-15 кДа. Белки среднего размера, как, например, приведенная на схеме алкогольдегидрогеназа, имеют мол.массу 100-200 кДа. Молекулярная масса высокомолекулярных ферментов, к которым относится глутаминсинтетаза, построенная из 12 мономеров, могут достигать 500 кДа. Эта функция в 1982 году перестала считаться уникальной. Выяснилось, что некоторые РНК тоже обладают каталитической активностью. Их называют РНКзимами или рибозиами.

Двигательные функции. Взаимодействие актина с миозином ответственно за мышечное сокращение и другие формы биологической подвижности. М иозин (слева) длиной 150 нм — один из наиболее крупных белков. Нитевидный актин (F-актин) образуется путем полимеризации относительно небольших молекул глобулярного актина (G-актин). Процессом сокращения управляют ассоциированный с F-актином тропомиозин и другие регуляторные белки.

Запасные функции. В растениях содержатся запасные белки, явлющиеся ценными пищевыми веществами, например, глиадин - белок зерен пшеницы. В организмах животных мышечные белки служат резервными питательными веществами, которые мобилизуются при крайней необходимости. В молоке содержится белок казеин.

Опорная – сухожилия, поверхности суставов соединения костей образованы в значительной степени белками, например, коллаген, эластин.

Энергетическая – аминокислоты белков могут поступать на путь гликолиза, который обеспечивает клетку энергией.

Трансформация энергии. Белки сечатки глаза родопсин и ретинен трансформируют световую энергию в электрическую.

Любой белок - амфотерный полиэлектролит. Белки способствуют поддержанию определенных значений рН в разных отсеках клетки, обеспечивая этим компартментализацию.

Изофункциональные белки – это семейства белков, выполняющие одинаковую или близкую функцию, но имеющие небольшие особенности в строении, что придает им свои физиологические особенности. Например, гемоглобины человека.

Гемоглобин А — тетрамер: (2a2b). Составляет около 98% гемоглобина эритроцитов взрослого человека.

Гемоглобин А₂ — тетрамер (2a2d). Его содержа­ние в эритроцитах взрослого человека равно 2%.

Гемоглобин эмбриональный — тетрамер (2a2e). Обнаруживается на ранних этапах развития плода.

Гемоглобин F — тетрамер (2a2g). Приходит на смену раннему гемоглобину плода на 6-м месяце развития.

Таким образом, все типы гемоглобина содержат одинаковую a-цепь и различаются по второй цепи. Гемоглобины выполняют одну функцию – транспорт кислорода, но благодаря особенностям строения различаются по степени сродства к кислороду. У гемоглобина F сродство к кислороду выше, это обеспечивает диффузию кислорода от гемоглобина А крови матери к гемоглобину F плода.

Изобелки – это множественные формы белка, обнаруживаемые в организме одного вида. Например, коллагены.

Гомологичные белки – это белки, выполняющие одинаковые функции в организме разных видов.

Семейства родственных белков. В ходе эволюции в пределах одного и того же вида биохимические замены аминокислот могут приводит к возникновению разных белков, выполняющих сходные функции и имеющих незначительные различия по аминокислотной последовательности. Например, белки суперсемейства иммуноглобулинов (рис.6).

Иммуноглобулины (Ig), или антитела, являются семейством Y-образных (по пространственной структуре) гликопротеинов, у которых обе вершины («буквы Y») могут связывать антиген. Иммуноглобулины находятся в виде мембранных белков на поверхности лимфоцитов и в свободном виде в плазме крови. На схеме показана структура наиболее важного из них — иммуноглобулина класса G (IgG). Молекула представляет собой крупный тетрамер (Н₂L₂ с 150 кДа) из двух идентичных тяжелых цепей (Н-цепей) и двух идентичных легких цепей (L-цепей). В обеих H-цепях имеется ковалентно связанный олигосахарид.

Иммуноглобулины расщепляются протеиназой папаином на два F_ab-фрагмента и один F_c-фрагмент. Оба F_ab-фрагмента (от англ. antigen binding fragment — антиген-связывающий фрагмент) состоят соответственно из одной L-цепи и N-концевой части H-цепи. Изолированные F_ab-фрагменты сохраняют способность связывать антиген. F_с-Фрагмент (от англ. fragment crystallizable — способный кристаллизоваться) состоит из С-концевой половины обеих H-цепей. Эта часть IgG выполняет функции связывания с клеточной поверхностью, взаимодействия с системой комплемента и участвует в переносе антител клетками.

 

Рис. 6

Несмотря на большое разнообразие в иммуноглобулинах соблюдается общий принцип строения. Обе тяжелые пептидные цепи (Н-цепи) IgG состоят из четырех глобулярных доменов V_H, С_H1, С_H2 и С_H3, обе легкие (L- цепи) — из двух глобулярных доменов C_L и V_L. При этом буквы С и V соответственно обозначают константные (англ. constant) и вариабельные (англ. variable) области. Обе тяжелые цепи, а также тяжелая цепь с легкой, связаны дисульфидными мостиками. Дисульфидные мостики внутри доменов стабилизируют третичную структуру. Домены имеют длину около 110 аминокислот и обладают взаимной гомологией. Такая структура антител, очевидно, возникла благодаря дупликации гена.

В центральной области молекул иммуноглобулинов расположен шарнирный участок, который придает антителам внутримолекулярную подвижность.

Классы иммуноглобулинов

Иммуноглобулины человека по структуре тяжелых цепей делятся на пять классов. Различия между IgA (с двумя подклассами), IgD, IgE, IgG (с четырьмя подклассами) и IgM определяются H-цепями, которые обозначаются греческими буквами — α, β, ε, γ и μ. L-Цепи имеют только две разновидности (κ и λ). IgM могут существовать в различных формах. Секретируемые IgM состоят из пяти взаимосвязанных димеров. IgA могут быть образованы из одного, двух или трех димеров. Олигомерные IgM и IgA удерживаются вместе благодаря связывающему J-пептиду (от англ. joining).

Иммуноглобулины всех пяти классов являются секретируемыми белками. Они поставляются в кровь зрелыми В-клетками, Ранние варианты IgM и IgD найдены также в виде интегральных мембранных белков на поверхности В-клеток.

Антитела имеют различные функции. При контакте с чужеродным антигеном первыми образуются lgM -антитела. Ранние формы IgM связаны с поверхностью В-клеток, более поздние формы секретируются в виде пентамеров плазматическими клетками. Антитела IgM особенно активны против микроорганизмов. В количественном отношении больше всего антител IgG. Они находятся в крови и в интерстициальной жидкости; с помощью рецепторов они могут также проходить в плаценту и вследствие этого переноситься от матери к плоду. IgA обнаруживаются преимущественно в кишечном тракте и секретах. IgE присутствуют в плазме здорового человека лишь в незначительных, концентрациях. Повышение уровня IgE наблюдается при аллергических реакциях и паразитарных инфекциях. Количества в плазме IgD, функция которого еще не выяснена, также весьма малы.

Методы исследования белков (рис. 7)

Высаливание

Растворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы. При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание). При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание). Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН₄)₂SО₄, разделить (фракционировать) смесь белков.

Диализ

Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.

Гель-фильтрация.

Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а). Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля, будут перемещаться с высокой скоростью. Средние и небольшие белки будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций. Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы.