Сравнительное исследование генетического материала.

Информация о совокупности характерных для каждого человека генетических признаков (генотипе) «записана» в виде определенной последовательности нуклеотидных оснований молекул ДНК, находящихся в 23 парах хромосом ядра и митохондриях клеток организма. При этом в каждой паре хромосом одна из них наследуется от матери, другая - от отца. Такой характер наследования предопределяет, что любой генетический признак ребёнка, информация о котором содержится в определенном локусе (участке молекулы ДНК), обязательно должен обнаруживаться в соответствующем локусе и у истинных биологических родителей этого ребенка.

Для решения поставленного вопроса проводили сравнительное исследование полиморфизма (разнообразия вариантов строения) генетического материала, выделенного из представленных тампонов образцами эпителия полости рта и слюной Михайлова А. Н., Олешкевич А. Ф. и Олешкевича А. Исследование проводили в ряде высокополиморфных локусов, содержащих участки с выраженными индивидуальными различиями в молекулярных размерах, обусловленными отличиями в количестве тандемно расположенных однотипных блоков последовательностей нуклеотидов у разных людей.

Выделение генетического материала

Генетический материал из образцов 3809А, 3809В и 3809C выделяли по общепринятой методике, основанной на высвобождении ДНК в ходе инкубации образцов биологического материала в лизирующем буфере, содержащем додецилеульфат натрия и протеиназу К. Очистку ДНК от продуктов расщепления биополимеров проводили последовательными экстракциями фенолом и хлороформом, адсорбционной хроматографией на кальций-тартратном гелеи гель-фильтрацией на крупнопористых поливиниловых носителях. Контрольный электрофорез выделенных образцов показал, что качествен­ные и количественные характеристики образцов ДНК 3809А, 3809В и 3809С соответствуют предъяв­ляемым к ним требованиям и позволяют проводить дальнейшие исследования.

Исследование полиморфизма генетического материала

Сравнительный анализ полиморфизма генетического материала в образцах ДНК 3809А, 3809В и 3809С проводили в семнадцати локусах, исследуемых при проведении генотипирования с использовани­ем наборов «GenePrint PowerPlex™ 16 System» («Promega», США) и «AmpFlSTR Identifier™ PCR Amplification Kit» («Applied Biosystems», США). Основные генетические характеристики исследуемых локусов приве­дены в табл. 1.

 

Таблица 1. Основные генетические характеристики исследуемых локусов хромосомной ДНК человека

Обозначение локуса в со­ответствии с общепри­нятой классификацией	Хромосом­ная локали­зация	Число известных аллелей	Источ­ник	Обозначение локуса в со­ответствии с общепринятой классификацией	Хромосом­ная локали­зация	Число из­вестных ал­лелей	Источ­ник
трох	2p25.1-pter		5)	vWA	12pi2-pter		5)
D2S1338	2q3S-37.t		5)	D13S317	13q22-q31		5)
D3S1358	3p		5)	PentaE	15д26.2		5)
FGA	4q28		5)	D16S539	16q24-qter		5)
CSF1PO	5q33.3-q34		5)	D18S51			5)
D5S818	Sq233-32		5)	D19S433	WqlMU		5)
D7S820	7дПД1-q22		5)	D21SI1	21qll-<ffl	>25	5)
D8S1179	8q		5)	PentaD	21q22.3		5)
ТН01	11p15.5		5)

 

Генотипирование выделенных образцов ДНК осуществляли с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего проводить специфическую амплификацию (увеличение коли­чества) строго определенных, участков молекул ДНК. ПЦР проводили с использованием автоматического программируемого термоциклера «GeneAmp PCR System 9700» («Applied Biosystems», США). Проведение ПЦР осуществлялось в мультиплексном режиме с использованием компонентов набора «GenePrint PowerPlex 16 System» реагентов и условий реакции, соответствующих известным рекомендациям.

Характерное для каждого из образцов сочетание аллелей (вариантов строения молекул ДНК) выявляли путем злектрофоретического разделения продутов ПЦР в ДНК-секвенаторе «MegaBACE 750» (система для автоматического капиллярного электрофореза с лазерным конфокальным сканирующим детектором флуоресценции; [«Amersham Biosciences», C1HAV) в режиме генотипирования (первичные результаты анализа хранятся в наблюдательном производстве ГУ «ЦСЭиК Министерства юстиции Республики Беларусь»). Определение размеров выявленных аллелей и соответствующих генотипов ДНК в исследуемых локусах проводили с использованием внутренних стандартов размера «ET550-R Size Standart», стандатированных наборов аллелей («лесенок») и специализированной программы «MegaBACE Genetic Profiler v.2.2» («Amersham Biosciences», США).

B результате исследования в каждом локусе у ребёнка выявляются «материнские» (т.е. унаследованные от матери) и «отцовские» (т.е. унаследованные от истинного биологического отца) генетические признаки (аллели). В случае истинного биологического отцовства во вс ех исследуемых локусах наблюдается совпадение признаков ребёнка с одним (или обоими) из признаков предполагаемого отца. В этом случае, поскольку профиль генотипов по исследованным локусам не является, в общем, уникальным для каждого человека, результаты исследования оцениваются средствами теории вероятностей и математической статистики на основании данных о встречаемости аллелей в европеоидных популяциях.

Вывод же об исключении отцовства делается при отсутствии совпадения «отцовских» признаков ребенка спризнаками предполагаемого отца в двух или более локусах.

 

Результаты исследования

При проведении генотипирования образцов ДНК 3809А, 3809В, 3809С были получены результаты, обобщенные в нижеследующей таблице 2.

 

Таблица 2. Генетические характеристики исследуемых образцов ДНК 3809А, 3809В, 3809С.

 

Локус	Генотипы исследуемых биологических образцов	Наследование признаков ребенком
3809А предполагаемый отец Михайлов Алек­сандр Николаевич	3809В ребенок Олешкевич Артур Францевич	3809С мать Олешкевич Алиция Францевна	«материнский» набор признаков	«отцовский» набор признаков
vWA	14/ 18	14/ 18	14/17
TH01	6 /9	6 /7	7/9
TPOX	10/ 11	10/ 11	11/11
CSF1PO	12/ 12	12/ 12	12/12
D5S818	9/ 10	10 /11	11/13
D13S317	8/ 11	11 /12	9/12
D7S820	10 /11	9/ 10	9/11
D16S539	11 /14	11 /12	12/13
D3S1358	14 /15	14 /15	15/15
D8S1179	12/ 12	12 /14	14/14
D18S51	15 /16	12/ 15	12/18
D21S11	31/ 31.2	31.2 /34.2	30/34.2	34.2	31.2
FGA	21/ 25	23.2/ 25	23/23.2	23.2
D2S1338	24/ 27	20/ 27	20/25
D19S433	14/ 14	13/ 14	13/14	13 или 14	14 или 13
Penta E	7 /10	7 /7	7/17
Penta D	12 /12	12 /12	11/12
Amelogenin	ХУ (муж.)	ХУ (муж.)	ХХ (жен.)

 

Анализ полученных результатов сравнительного генотипирования показывает, что во всех семнадцати исследованных локусах в генотипах ДНК ребенка Олешкевича А.Ф. и предполагаемого отца Михайлова А.Н. имеются совпадающие признаки. При этом в шестнадцати локусах признаки ребенка отчетливо дифференцируются на «материнские» (т.е. унаследованные от матери) и «отцовские» (т.е. унаследованные от истинного биологического отца), в одном локусе (D19S433) невозможно однозначно установить, какие из признаков унаследованы ребенком от каждого из родителей.

Для каждого из исследованных локусов ожидаемые вероятности (Р) совпадения «отцовских» признаков ребенка Олешкевича А.Ф. с признаками случайно взятого человека равны:

 

Р (vWA) = 0.202*(2-0.202) = 0.363

Р (TH01) = 0.237*(2-0.237) = 0.418

Р (TPOX) = 0.056*(2-0.056) = 0.109

Р (CSF1PO) = 0.330*(2-0.330) = 0.551

Р (D5S818) = 0.057*(2-0.057) = 0.111

Р (D13S317) = 0.305*(2-0.305) = 0.517

Р (D7S820) = 0.295*(2-0.295) = 0.503

Р (D16S539) = 0.319*(2-0.319) = 0.536

Р (D3S1358) = 0.117*(2-0.317) = 0.221

Р (D8S1179) = 0.162*(2-0.162) = 0.298

Р (D18S51) = 0.168*(2-0.168) = 0.308

Р (D21S11) = 0.095*(2-0.095) = 0.181

Р (FGA) = 0.069*(2-0.069) = 0.133

Р (D2S1338) = 0.001*(2-0.001) = 0.003

Р (D19S433) = 0.341*(2-0.341) + 0.289*(2-0.289) – 2*0.341*0.289 = 0.863

Р (Penta E) = 0.171*.(2-0.171) = 0.312

Р (Penta D) = 0.235*(2-0.235) = 0.414

 

Суммарная вероятность (РΣ) случайного совпадения во всех семнадцати исследованных локусах «отцовских» признаков ДНК ребенка Олешкевича А.Ф. с признаками случайно взятого человека оценивается следующим образом:

 

РΣ = Р (vWA) * Р (TH01) * Р (TPOX) * Р (CSF1PO) * Р (D5S818) * Р (D13S317) * Р (D7S820) * Р (D16S539) * Р (D3S1358) * Р (D8S1179) * Р (D18S51) * Р (D21S11) * Р (FGA) * Р (D2S1338) * Р (D19S433) * Р (Penta E) * Р (Penta D) = 2.302*10ˉ¹¹, т.е. такое совпадение возможно с одним из 43 миллиардов человек.

 

СИНТЕЗИРУЮЩАЯ ЧАСТЬ

Возможность установления биологического отцовства путем анализа ДНК основывается на строгих научных критериях, согласно которым характерное для каждого человека сочетание признаков определяется генетической информацией, содержащейся в 23 парах хромосом, при этом в каждой паре сочетаются одна хромосома, унаследованная от отца, и вторая – от ма­тери. Такой характер наследования предопределяет, что любой генетический признак ребёнка, информация о котором содержится в определенном участке ДНК (локусе), представляет собой комбинацию признаков, характерных для каждого из родителей. При этом любой из выявляе­мых в исследуемом локусе у ребёнка вариантов признака (аллелей) обязательно должен обна­руживаться у матери («материнский» аллель) или отца («отцовский» аллель).

Для решения вопроса о биологическом отцовстве Михайлова А. Н. проводили срав­нительное исследование полиморфных участков ДНК, выделенных из представленных тампонов с мазками эпителия полости рта и слюной Михайлова А. Н., Олешкевич А. Ф. и Олешкевича А. Ф. Исследование осуществляли в участках ДНК с тандемно расположен­ными повторами (локусах vWA, TH01, ТЮХ, CSF1PO, D5S818, D13S3I7, D7S820, D16S539 D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11, FGA, D2S1338, D19S433, Penta E, Penta D), характеризующихся наличием отчетливо различающихся генетических признаков (аллелей), сочетание кото­рых индивидуально для каждого человека, одинаково в клетках всех его органов и тканей (в том числе, – в клетках крови и слюны), сохраняется на протяжении всей жизни и насле­дуется потомками в соответствии с известными биологическими законами.

В результате проведенного исследования установлено, что во всех семнадцати исследо­ванных локусах каждый из аллелей ребёнка Олешкевича А. Ф. совпадает по молекулярным размерам с аллелями его матери Олешкевич А. Ф. или предполагаемого отца Михайлова А. Н. При этом «отцовские» аллели ребёнка во всех исследуемых локусах совпадают с аллелями предполагаемого отца.

Поскольку известно, что половину признаков ребёнок всегда наследует от матери, а вто­рую половину – от отца, выявленное при проведении экспертного исследования в семнадцати локусах совпадение «отцовских» генетических признаков ребёнка с признаками предполагае ­ мого отца является основанием для вывода о подтверждении биологического отцовства Михайлова Александра Николаевича в отношении ребёнка Олешкевича Артура Францевича.

С учетом известных значений частот встречаемости совпадающих у ребёнка и предпола­гаемого отца признаков установлено, что вероятность одновременного совпадения в семна­дцати локусах «отцовских» признаков ребёнка с признаками случайно взятого человека оцени­вается как величина не превышающая 2,302*10ˉ¹¹. Это означает, что такое совпадение может наблюдаться в среднем с одним из 43 миллиардов человек.

Таким образом, результаты сравнительного исследования наследственных признаков ДНК, выделенных из представленных образцов биологического материала (тампонов-мазков с соскобами эпителия полости рта и слюной) предполагаемого отца Михайлова Александра Ни­колаевича, ребёнка Олешкевича Артура Францевича и его матери, Олешкевич Алиции Францевны, с высокой степенью достоверности подтверждают биологическое отцовство Михайлова А. Н. в отношении указанного ребёнка. При этом степень достоверности вывода о биологи­ческом отцовстве Михайлова А. Н. составляет не менее 99,99999999%.

ВЫВОД

Согласно результатам проведенного сравнительного анализа ДНК, выделенных из представленных на исследование образцов биологического материала, биологическое отцовство Михайлова Александра Николаевича в отношении ребёнка Олешкевича Артура Францевича, родившегося 17 октября 2008 года у Олешкевич Алиции Францевны, подтверждается (с достоверностью не менее 99,99999999%).

 

________________ А.М. Мирный

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

 

24 марта 2010 года

 

Суд Ленинского района г. Гродно,

судья Муха Людмила Константиновна.

секретарь судебного заседания - помощник судьи Миронова Н.Е.,

с участием истицы Олешкевич Алиции Францевны,

ответчика Михайлова Александра Николаевича,

рассмотрев в открытом судебном заседании в г. Гродно гражданское дело по иску Олешкевич Алиции Францевны к Михайлову Александру Николаевичу об установлении отцовства и взыскании алиментов,

 

УСТАНОВИЛ:

 

Определением суда Ленинского района г. Гродно от 18 января 2010 г. производство по данному гражданскому делу было приостановлено в связи с проведением судебно-геномной экспертизы.

В настоящее время отпали обстоятельства для дальнейшего приостановления производства по делу, поэтому производство по настоящему гражданскому делу следует возобновить и назначить его к слушанию.

На основании изложенного и руководствуясь ст. 163 ГПК Республики Беларусь Республики Беларусь, суд

 

ОПРЕДЕЛИЛ:

 

Производство по данному гражданскому делу возобновить.

Судебное разбирательство назначить на 16.04.2010 к 11.00 часам. Стороны извещены.

На определение может быть подана частная жалоба или принесен частный протест в Гродненский областной суд через суд Ленинского района г. Гродно в течение 10-ти дней со дня его вынесения.

 

СУДЬЯ:

 

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ