Определение активности ЛДГ (общая)

И Н С Т Р У К Ц И Я

По выполнению практической работы № 22 по теме

«Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), гидроксибутиратдегидрогеназы (НBDН) в сыворотке крови кинетическим методом»

Цели занятия:

1. Ознакомить учащихся с методами исследования активности ЛДГ и НБДН в биохимических отделах КДЛ.

2. Сформировать понятие о роли ЛДГ и НBDН в организме, механизме ферментативного катализа, изоформах ЛДГ, их значении в диагностике патологических состояний, принципе кинетического метода определения активности ЛДГ и НBDН в сыворотке крови.

3. Научить определять активность ЛДГи НBDН в сыворотке крови кинетическим методом, интерпретировать полученный результат.

Исходный уровень знаний и умений.

Учащийся должен знать:

1.Теоретический материал по теме «Значение ферментов в медицине».

Учащийся должен уметь:

1. Провести определение активности ЛДГи НBDН в сыворотке крови кинетическим методом, интерпретировать полученный результат.

Структура занятия.

1. Теоретическая часть:

Ø Микролекция

1. Практическая часть:

Ø Провести определение активности ЛДГи НBDН в сыворотке крови кинетическим методом, интерпретировать полученный результат.

Микролекция

Лактатдегидрогеназа — гликолитический фермент, обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту. Для лактатдегидрогеназы в качестве промежуточного акцептора водорода требуется НАД. Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой, может быть представлена в следующем виде:

 

L-лакгат + НАД ↔ пируват + НАД Н + Н+.

 

Фермент широко распространен в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. Изменения в строении белковой части изофермента обусловливают их различные физико-химические свойства, что, в частности, сказывается в неодинаковой электрофоретической подвижности разновидностей этого фермента в агаровом, крахмальном, полиакриламидном и других гелях. В сыворотке крови обнаружено пять изоэнзимов лактатдегидрогеназы: ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5, располагающихся в геле в порядке убывания их электрофоретической подвижности. Установлено, что фракция ЛДГ1 происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ5 — из печени. В отличие от последней ЛДГ1 обладают большей устойчивостью к действию мочевины.

 

Лактатдегидрогеназа содержится не только в сыворотке, но и в значительном количестве в эритроцитах, поэтому сыворотка, используемая для анализа, должна быть свежей, лишенной следов гемолиза.

 

Исследование общей активности фермента характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов организма, а определение активности отдельных изоэнзимов ЛДГ способствует диагностике некоторых заболеваний сердца, печени и других органов.

Альфа-гидроксибутират дегидрогеназа – это изофермент лактатдегидрогеназы-1 (ЛДГ-1) - фракция ЛДГ, характерная для сердечной мышцы.

Изофермент ЛДГ 1 присутствует в большой концентрации в мышце сердца (тетрамер НННН), а также в эритроцитах и корковом веществе почек;

Практическая часть

Определение активности ЛДГ (общая)

Принцип метода Лактатдегидрогеназа катализирует превращение лактата в пируват при одновременном восстановлении НАД в НАД(Н), который далее восстанавливает в присутствии N-метилфеназонийметилсульфата йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан.

Основные показания к назначению анализа:

1. ретроспективная диагностика инфаркта миокарда;
2. определение степени активности заболевания при криптогенном фиброзном альвеолите и наружном аллергическом альвеолите;
3. маркер гемолиза in vivo (гемолитическая анемия) или в in vitro (артефакт);
4. мониторинг цитостатической химиотерапии различных опухолей.

Пределы активности:

ЛДГ при температуре 37 °С — 0,66 —2,66 мккат/л;

Доля фермента, устойчивая к действию мочевины (%), — 60—80.

Необходимые реактивы

1. Молочная кислота 80%-ная.

2. Натрия гидроокись, растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л.

3. 0,45 моль/л раствор лактата натрия. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 5 мл 80%-ной молочной кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого натра до получения рН 7,5 и доводят объем водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.

4. Натрия фосфат пиро (Na4P2O7 ∙ 10 Н2О).

5. НСl 1 моль/л.

6. Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8: 6,69 г натрия пирофосфата растворяют в небольшом количестве воды, добавляют 1 моль/л раствор НСl до получения рН 8,8 и доводят объем водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

7. НАД-окисленная форма. Готовят из расчета 3 мг НАД на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.

8. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 моль/л раствора НСl при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором НСl до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года.

9. Пируват натрия (для построения калибровочной кривой): 11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой объем раствора до, метки; 1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой; 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Ход определения

Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, термостатируют 5 мин при температуре 37 °С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предварительно инкубированных при температуре 37 °С, и инкубируют смесь при температуре 37 °С в течение 15 мин. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостую пробу ставят, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.