Экспериментальное моделирование ФДЭ.

При выборе модели для лабораторного исследования ФДЭ внимание в первую очередь привлекает кровь. В самом деле, гемоглобин – белок, ответственный за транспорт кислорода от легких ко всем клеткам и тканям организма – сосредоточен в эритроцитах – главной составной части крови. В 1 мм³ крови содержится ~ 5×10⁶ эритроцитов, их суммарный объем превышает объем следующих за ними по присутствию в крови телец (лейкоцитов и тромбоцитов) примерно в 50 раз. Эритроцит представляет собой дискоцит (тор без отверстия) со средним диаметром ~ 8 мкм, наименьшей толщиной (в центре) ~ 0,9¸1 мкм и толщиной «бублика» ~ 1,7¸2,4 мкм (рис.7). Отметим, однако, что такая геометрия присуща эритроциту только в изотоническом растворе. Поскольку эритроцит не содержит ядра и его свойства определяются внешней мембраной, форма (а, следовательно, и соотношение между объемом и внешней поверхностью) эритроцита существенно зависят от осмотического давления (рис7б,в). Тем самым величина осмотического давления является параметром, определяющим ход транспорта газов через клетки и ткани, а с ним – и весь метаболизм клетки. Но присутствие ФС влияет как раз на мембранный транспорт, т.е. управляет осмотическим давлением. Одновременно ФС окисляет гемоглобин, поскольку ключевым процессом для ФДТ является генерация и последующее химическое тушение синглетного кислорода. Таким образом, именно эритроциты первыми «принимают на себя» воздействие ФС. Под действием ФС происходит сначала изменение геометрии эритроцитов, затем их гемолиз - разрыв мембраны и гибель эритроцита как организованной формы кровяных телец. При этом, ввиду преобладания эритроцитов среди других элементов крови, оптические, механические и прочие свойства крови определяются в основном эритроцитами. Следовательно, при гемолизе следует ожидать радикального изменения оптических свойств крови (поглощения, рассеяния), выражающегося в изменении экстинкции среды. Этот факт, давно известный биологам, и закладывается в основу лабораторного моделирования ФДЭ. С оптической точки зрения, кровь представляет собой суспензию (взвесь) эритроцитов в практически прозрачной среде. Уже изменение формы эритроцита приводит к слабому, но вполне регистрируемому изменению спектра пропускания суспензии, поскольку рассеяние при сферуляции эритроцитов возрастает, а поглощение падает. Суммарная экстинкция оказывается минимальной при полной сферуляции эритроцитов. Полная же гемолизация крови приводит к резкому падению оптической плотности, причем количественное описание этого эффекта на сегодня в литературе отсутствует. Если, например, предположить, что при разрыве мембраны все молекулы гемоглобина оказываются в растворе и рассеивают как рэлеевские частицы (средний размер молекулы гемоглобина 11´11´7 нм, т.е. наибольший поперечник мал по сравнению с длиной волны света), то такого резкого падения оптической плотности, как наблюдается в эксперименте, расчет не дает. Ряд гипотез, выдвигавшихся для объяснения этого эффекта, еще ждет своего экспериментального подтверждения. То, что в результате ФДЭ кровь из классической мутной среды (суспензия с большим рассеянием и поглощением) превращается в раствор, близкий к коллоидному, может быть взято за основу экспериментальной методики (рис.8).

6. Экспериментальное оборудование, материалы и расчёты.

Экстинкция суспензии эритроцитов измеряется на фотоколориметре (приборе, измеряющем оптическую плотность на различных длинах волн). Используемый в лабораторной работе колориметр КФК-2 позволяет проделывать это на 9 длинах волн от 315 до 750 нм. Тем самым можно, хотя и грубо, но построить кривую спектра пропускания исследуемых жидких препаратов. Величина пропускания Т определяется отношением прошедшего через образец потока излучения I к падающему потоку I₀, приведенными к одному и тому же поперечному сечению:

(2)

Для корректности определения Т оптическая схема колориметра содержит коллиматор и диафрагмы, обеспечивающие квазипараллельность проходящего через образец пучка излучения. Поскольку как спектральная интенсивность источника, так и спектральная чувствительность приемника зависят от длины волны, в приборе используется калибровочный канал, в который помещается кювета, заполненная растворителем (в данном случае, физраствором, оптическая плотность которого в рассматриваемом интервале длин волн мало отличается от водяной). Измерение Т на каждой длине волны производится в 2 приема: сначала в луч вводится калибровочная кювета, и с помощью регулировки чувствительности приемного канала показания прибора устанавливаются на Т = 1 (шкала отградуирована в процентах). После этого прибор переключается на измерительный канал (калибровочная кювета выводится из луча и точно на ее место помещается измерительная кювета с испытуемой жидкостью). При правильной калибровке (100% пропускания при открытом окне фотоприемника и 0% при закрытом) показания прибора дают величину искомого пропускания. Против шкалы пропускания (равномерная от 0 до 100%) нанесена шкала оптических плотностей Д (логарифмическая) в соответствии с формулой

Д = - lg T (3)

Величина Д меняется в пределах от 0 (Т = 1) до ¥ (Т = 0), однако фактическая возможность измерения Д определяется ценой деления шкалы. Так, при Т = 0,1 Д = 1; при Т = 0,01 Д = 2; производить измерения с точностью, превы-

шающей 1% по Т, нереально, причем при малых пропусканиях (Т < 10%) ошибка резко возрастает. Поэтому реальным диапазоном измерения Д является 0 < Д < 2. По этой причине фактическая возможность абсолютного измерения концентрации исследуемого вещества по оптической плотности, в соответствии с формулой Ламберта-Бера

Д = с×e×L (4)

где с – концентрация, e - коэффициент молярной экстинкции, L – толщина образца (длина оптического пути излучения в испытуемой среде), затруднена. Однако относительная концентрация выживших частиц в зависимости от времени облучения t и дозы облучения D, имеющей смысл суммарной падающей на исследуемый пул клеток энергии излучения, может быть найдена на основе предложенной в МГУ им. М.В. Ломоносова [3] и развитой в МГТУ им. Н.Э. Баумана математической модели (см. приложение 1). Простейший вариант этой модели основан на предположениях о пренебрежении репаративными процессами, преобладании химического механизма тушения, отсутствии кислородного голодания и определении доли выживших клеток сразу после прекращения облучения. Результатом расчета при таких предположениях будет следующая зависимость относительной концентрации от дозы:

(5)

Здесь обозначено x t = D – доза воздействующего излучения, - постоянная, характеризующая скорость гибели сенсибилизированных клеток в начальный момент облучения. Найденная зависимость (5), будучи построенной в координатах (), и называется дозовой кривой. Коэффициент характеризует крутизну этой кривой (см. приложение 1). В виде дозовой кривой можно представить и экспериментальные данные. Пример дозовой кривой приведён на рис. 9. Поскольку в дозовую кривую (5), определяющую зависимость ln от дозы облучения, входит не абсолютная концентрация сенсибилизированных частиц, а относительная, приводить в соответствие измеряемую оптическую плотность Д с абсолютной молярной концентрацией с нет необходимости, тем более, что коэффициент молярной экстинкции e априори неизвестен.

Рис.8. Схема экспериментальная установки для наблюдения ФДЭ на взвеси эритроцитов: 1 – источник света, 2 – конденсор, 3.6.8 – диафрагмы; 4 – коллиматор; 5 – сменные интерференционные фильтры; 7 – кювета с исследуемой жидкостью; 9 – светоделительная пластинка; 10 – фотодиод; 11 – фотоэлемент; 12 – усилитель постоянного тока; 13 – измерительный прибор.

Рис.9. Расчётные дозовые кривые в предположении о преобладании химического механизма тушения.

Правильное построение дозовых кривых для ФДЭ должно содержать: а) выбор концентрации эритроцитов в суспензии в соответствии с исходным пропусканием образца в пределах Т = 20¸30%, чтобы диапазон изменения пропускания при гемолизе эритроцитов был велик по сравнению с исходной величиной пропускания; б) выбор концентрации ФС, достаточно большой для обеспечения полного поражения всех эритроцитов в образце, но при этом достаточно малой для того, чтобы исходное пропускание образца с добавленным ФС не сильно отличалось от несенсибилизированного (т.е. находилось в пределах тех же 20¸30%); в) обязательное измерение характеристик контрольного образца, выдерживаемого параллельно с облучаемым в темноте, с тем, чтобы выделять при каждом измерении ту оптическую плотность, которая определяется именно ФДЭ, а не всеми прочими причинами. Основной серии измерений, позволяющих построить дозовую кривую, должны предшествовать 2 серии предварительных измерений: а) спектральной характеристики пропускания суспензии эритроцитов (несенсибилизированной); б) спектральной характеристики пропускания раствора ФС. Эти кривые позволяют определить как предпочтительную длину волны источника засветки, так и длину волны, на которой следует вести измерения Т и Д для наиболее заметного проявления ФДЭ. Очевидно, что первая должна быть близка к максимуму поглощения ФС, вторая – к максимуму экстинкции суспензии эритроцитов. Доза облучения (в относительных единицах) определяется посредством измерения времени облучения. В качестве контрольного, как в начале, так и по окончании опыта, следует провести измерение плотности потока излучения (освещенности), даваемой используемым источником. Это необходимо для того, чтобы можно было считать зависимость дозы D облучения от времени t линейной (обеспечение линейности, согласно формулам (13) и (5), имеет место только при I₀ = const).

Выполнение работы.