Занятие 18
Переваривание и всасывание белков.
Анализ желудочного сока.
Цель занятия: сформировать представления о пищевой ценности белков, молекулярных механизмах их переваривания и всасывания в желудочно-кишечном тракте, путях формирования пула свободных аминокислот тканей и жидкостей организма. Освоить методы определения кислотности и патологических компонентов желудочного сока.
Исходный уровень знаний и навыков
Студент должен знать:
1 Строение, классификацию и свойства основных классов аминокислот.
2 Уровни структурной организации белковой молекулы.
3 Механизм микросомального окисления.
4 Механизмы мембранного транспорта веществ.
Студент должен уметь:
1 Проводить титрационный анализ.
2 Проводить качественные реакции на кровь и молочную кислоту.
Структура занятия
Теоретическая часть
1.1 Роль белков в питании. Полноценные и неполноценные белки. Нормы белка в питании. Заменимые и незаменимые аминокислоты. Азотистый баланс.
1.2 Обмен простых белков. Переваривание белков в ЖКТ. Состав и свойства желудочного сока. Значение компонентов сока в переваривании белков (HCl, пепсин, слизь и др.). Характеристика пепсина. Механизмы образования и секреции HCl в желудочном соке. Регуляция секреции HCl (роль гистамина, гастрина, ацетилхолина и др.).
1.3 Кишечный сок. Его состав и свойства. Характеристика панкреатических и кишечных ферментов. Механизм активации трипсина, химотрипсина и др.
1.4 Значение градиента pH соков ЖКТ в переваривании белков. Механизмы переваривания белков и всасывания аминокислот в ЖКТ.
1.5 Медиаторы и гормоны ЖКТ – гистамин, серотонин, секретин, холецистокинин, гастроингибирующий пептид, соматостатин, глюкагон, энкефалины и др.
1.6 Гниение белков в толстом кишечнике. Обезвреживание продуктов гниения в печени.
1.7 Эндогенный пул аминокислот в тканях – пути формирования и утилизации.
Практическая часть
2.1 Решение задач.
2.2 Проведение повторного инструктажа по технике безопасности.
2.3 Лабораторные работы.
Задачи
1 Какие соединения являются незаменимыми факторами питания:
а) тре; б) гомоцистеин; в) фолиевая кислота; г) цис; д) креатин; е) холин?
2 Какие аминокислоты являются заменимыми в питании человека:
а) лиз; б) фен; в) тир; г) тре; д) про; е) вал?
3 Глутатион не содержит:
а) тре; б) сер; в) глу; г) гли; д) мет; е) цис?
4 Животные белки являются более полноценными по сравнению с растительными, потому что:
а) в животных гликопротеидах содержатся редкие углеводы;
б) в них больше содержится сер и гли;
в) животные белки больше адсорбируют микроэлементов;
г) среднее содержание три и лиз в животных белках выше;
д) отличаются более высокой усвояемостью;
е) животные белки больше адсорбируют витаминов группы B?
5 Какие аминокислоты способны поддерживать у здорового человека азотистый баланс:
а) тре; б) тир; в) фен; г) ала; д) сер; е) глу; ж) лиз; з) цис; и) вал?
6 Какие ферменты являются более важными для переваривания белков:
а) энтерокиназа; б) карбоксипептидаза; в) гистидин аммиак-лиаза; г) пепсин; д) химотрипсин; е) трипсин; ж) эластаза; з) амилаза; к) карбангидраза?
7 Какие соединения будут инициировать выделение кишечником гастрина:
а) этанол; б) пищевые жиры; в) глюкоза; г) белок; д) секретин; е) NaCl?
8 В чем причина снижения продукции HCl при гиповитаминозе B1:
а) повышенное образование ацетилхолина;
б) пониженное образование и ускоренный гидролиз ацетилхолина;
в) торможение декарбоксилазных реакций;
г) снижение активности ферментов b-окисления;
д) нарушение транспорта O2;
е) усиленная секреция электролитов?
9 Механизм активации протеаз ЖКТ включает:
а) фосфорилирование проферментов;
б) ограниченный протеолиз;
в) гидроксилирование;
г) оптимум pH;
д) формирование оптимальной среды электролитов;
е) активацию кофакторами?
10 Каков азотистый баланс у человека, если с пищей поступило 80 г белка за час, а с мочой за это время выделилось 16 г азота?
Лабораторные работы
Лабораторная работа № 1. Количественное определение общей кислотности, общей, свободной и связанной соляной кислоты в одной пробе желудочного сока
Принцип метода. Основан на титровании желудочного содержимого раствором 0,1н NaOH в присутствии индикаторов с различными зонами перехода. Кислотность желудочного сока выражают количеством миллимоль едкого натра, нейтрализующего 1 л желудочного сока.
Основные фракции кислот желудочного сока:
“общая кислотность” желудочного сока – это сумма всех кислот желудочного содержимого;
“свободная соляная кислота” – свободная минеральная HCl;
“связанная соляная кислота” – кислореагирующие соли (хлориды) белков и других слабых оснований;
“общая соляная кислота” – сумма свободной и связанной HCl.
Количественное определение свободной соляной кислоты. Свободная соляная кислота оттитровывается раствором 0,1н NaOH в присутствии индикатора диметиламиноазобензола, имеющего зону перехода окраски от красной до оранжевой при pH 3,0. Слабые же кислоты (молочная, уксусная кислота, кислые фосфаты и связанная соляная кислота) при pH 2,9–4,0 находятся в растворе в недиссоциированном состоянии и в реакцию со щелочью не вступают.
Ход работы. К 10 мл желудочного сока добавить 1–2 капли спиртового раствора диметиламиноазобензола и титровать раствором 0,1н NaOH до появления оранжевой окраски.
Произвести расчет на 1000 мл желудочного сока. Так как затраченное на титрование количество едкого натра эквивалентно количеству соляной кислоты в пробе желудочного сока, то количество соляной кислоты в 1 л желудочного сока (в моль/л) составит
a ´ 0,1 ´ 1000
X = ¾¾¾¾¾¾¾ (1)
b
| где а | – | количество 0,1н раствора NaOH, затраченное на титрование, мл; |
| 0,1 | – | количество NaOH в 1 мл 0,1 N раствора, моль; |
| b | – | количество желудочного сока, взятого для титрования, мл; |
| – | объем желудочного сока, мл. |
Количественное определение общей кислотности желудочного сока. Титрование общей кислотности желудочного сока проводится раствором 0,1н NaOH в присутствии индикатора фенолфталеина с зоной перехода окраски в пределах pH 8,2–10,0. При pH ниже 8,2 он бесцветный, а при pH выше 10,0 – красный.
Ход работы. К 10 мл профильтрованного желудочного сока добавить 1–2 капли раствора фенолфталеина и титровать 0,1н раствора NaOH до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Произвести расчет на 1000 мл желудочного сока.
Количественное определение общей кислотности, общей, свободной и связанной соляной кислоты в одной порции желудочного сока.
Ход работы. Отмерить в колбочки по 10 мл желудочного сока и добавить по 1-2 капли диметиламиноазобензола и фенолфталеина. Титровать 0,1н раствором NaOH до появления оранжевого окрашивания (первая отметка количества израсходованного 0,1н раствора NaOH). Затем продолжить титрования до лимонно-желтого цвета (вторая отметка) и, наконец, до розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин (третья отметка).
В процессе титрования отсчет ведется от начальной точки!
Первая отметка соответствует количеству свободной соляной кислоты, третья – общей кислотности. Вторая отметка используется для расчета количества общей соляной кислоты. Среднее арифметическое между вторым и третьим пунктом соответствует общей соляной кислоте. Количество связанной соляной кислоты вычисляется как разница между общей и свободной соляной кислотой. Например, при титровании 0,1н раствором едкого натра затрачено титрованного раствора (с начала титрования): до первой отметки (оранжевый цвет) – 3,3 мл, до второй (лимонно-желтый цвет) – 4,6, до третьей (розовый цвет) – 5,6 мл. Среднее между второй и третьей отметкой –
(4,6 + 5,6)/2 = 5,1 мл.
Произвести расчет содержания свободной соляной кислоты, общей соляной кислоты, общей кислотности на 1000 мл желудочного сока по формуле (1).
Этот способ расчета неприменим при наличии молочной кислоты в желудке. Поэтому в пробах желудочного сока, содержащего молочную кислоту, ограничиться вычислением свободной соляной кислоты и общей кислотности.
Норма. Показатели кислотности профильтрованного желудочного содержимого взрослого человека после стандартногопробного завтрака составляют:
- общая кислотность – 40–60 ммоль/л (новорожденные – 2,8 ммоль/л; дети до года – 4–20 ммоль/л);
- свободная HCl – 20–40 ммоль/л (новорожденные – 0,5 ммоль/л);
- связанная HCl – 10–20 ммоль/л;
- общая HCl – 30–60 ммоль/л.
Полученные данные вносятся в таблицу:
| Задача | Цвет | V 0,1 н NaOH, мл | Содержание HCl, ммоль/л | Общая кислотность | Выводы | ||
| свободная | связанная | общая | |||||
| Оранжевый | |||||||
| Желтый | |||||||
| Розовый | |||||||
| Оранжевый | |||||||
| Желтый | |||||||
| Розовый | |||||||
| Оранжевый | |||||||
| Желтый | |||||||
| Розовый |
Клинико-диагностическое значение. При различных заболеваниях желудка кислотность может быть повышенной, пониженной и нулевой. При язвенной болезни желудка или гиперацидном гастрите наблюдается гиперхлоргидрия – увеличение содержания свободной соляной кислоты и общей кислотности. При гипоацидном гастрите или раке желудка отмечается гипохлоргидрия – уменьшение количества свободной соляной кислоты и общей кислотности. При раке желудка, хроническом атрофическом гастрите отмечается полное отсутствие соляной кислоты и значительное снижение общей кислотности – ахлоргидрия. При злокачественном малокровии, раке желудка наблюдается полное отсутствие соляной кислоты и пепсина – ахилия.
Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
Лабораторная работа № 2. Обнаружение патологических компонентов желудочного сока
а) Обнаружение молочной кислоты по реакции Уффельмана. [AK1]
Принцип метода. При взаимодействии фенолята железа, имеющего фиолетовый цвет, с лактатом образуется лактат железа желто-зеленого цвета.
Ход работы. К 20 каплям раствора фенола добавить 1-2 капли раствора хлорного железа. Получается раствор фенолята железа фиолетового цвета. В пробирку с фенолятом железа прилить по каплям желудочный сок (нормальный и сок, содержащий молочную кислоту).
В присутствии молочной кислоты фиолетовая окраска переходит в желто-зеленую вследствие образования лактата железа. При одновременном присутствии соляной кислоты жидкость обесцвечивается. Это объясняется тем, что сильная соляная кислота полностью разрушает комплекс железа с фенолом, а также вытесняет более слабую молочную кислоту из ее соли; вследствие этого реакция на присутствие молочной кислоты отрицательная.
Клинико-диагностическое значение. Органические кислоты (молочная, уксусная, масляная и др.) имеют обычно микробное происхождение и появляются в желудочном содержимом в результате ахлоргидрии и последующего сбраживания компонентов пищи. Наличие органических кислот в желудочном содержимом натощак часто встречается при атрофических гастритах и раке желудка.
Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
б) Бензидиновая проба на кровь.
Принцип метода. Гемоглобин обладает каталазной активностью и разлагает пероксид водорода с образованием молекулярного кислорода, который окисляет бензидин или другой краситель. При этом происходит изменение окраски с бесцветной на темно-синюю.
Ход работы. В пробирку с 1 мл желудочного сока добавляют 4-5 капель 0,2 %-го спиртового раствора бензидина и 5 капель 1 %-го раствора пероксида водорода. При наличии в желудочном соке крови в результате окисления бензидина развивается синее окрашивание.
Полученные данные вносятся в таблицу:
| Определяемый компонент | Используемые реактивы | Пробы желудочного сока | |
| в норме | при патологии | ||
| Общая кислотность | Фенолфталеин | ||
| Свободная HCl | Диметиламиноазобензол | ||
| Лактат (молочная к-та) | Фенолят железа | ||
| Кровь | Бензидин |
Примечание – Если результаты какой-либо работы являются отрицательными, то в соответствующей графе ставится прочерк.
Клинико-диагностическое значение. Кровь появляется в желудочном содержимом при изъязвлении стенок желудка при язвенной болезни, эрозивном, язвенном гастрите, ожогах слизистой желудка и раке желудка.
Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
Рекомендуемая литература
Основная
1 Материал лекций.
2 Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 319–336; 1998. С. 409–429.
3 Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 303–308.
Дополнительная
4 Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 2. С. 267–298.
5 Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 255–258.
6 Элементы патологической физиологии и биохимии / Под ред. Ашмарина И. П. М.: Изд-во МГУ, 1992. С. 57–69.
Занятие 19
Тканевый обмен аминокислот.
Обезвреживание продуктов обмена
Цель занятия: сформировать представления об основных путях метаболизма свободных аминокислот в тканях. Изучить механизмы и значение реакций детоксикации аммиака в норме и при патологии. Освоить методику определения концентрации мочевины в сыворотке крови и моче.
Исходный уровень знаний и навыков
Студент должен знать:
1 Строение, классификацию и свойства основных классов аминокислот.
2 ЦТК, реакции, ферменты, механизмы регуляции.
3 Механизм микросомального окисления.
4 Строение витамина В6 и его коферментные формы.
Студент должен уметь:
1 Проводить исследование на колориметре.
Структура занятия
Теоретическая часть
1.1 Основные реакции обмена аминокислот:
1.1.1 Реакции на радикал:
а) гидроксилирование (про, лиз, фен). Механизм микросомального окисления (роль аскорбата, NADPH, цитохрома P450 и др.), примеры, биологическое значение;
б) разрыв (механизм, биологическое значение);
в) метилирование и др.
1.1.2 Реакции на карбоксильную группу:
а) декарбоксилирование (на примере гис, тир, трп, глу) – механизм, ферменты, биологическая роль;
б) восстановление – ферменты, биологическая роль.
1.1.3 Реакции на аминогруппу:
а) виды дезаминирования (окислительное, восстановительное, гидролитическое, внутримолекулярное), их медико-биологическое значение;
б) прямое окислительное дезаминирование – механизм, ферменты, коферменты, биологическое значение;
в) реакции переаминирования – ферменты, коферменты, биологическое значение;
г) непрямое окислительное дезаминирование – механизм, ферменты, коферменты, биологическое значение.
1.2 Аммиак, пути его образования и механизмы токсичности.
1.2.1 Пути детоксикации аммиака:
а) восстановительное аминирование;
б) образование амидов (глн и асн);
в) аммониогенез;
в) биосинтез мочевины, реакции, ферменты, локализация, биологическая роль цикла синтеза мочевины (ЦСМ). Энергетическая емкость ЦСМ. Связь ЦСМ с ЦТК и обменом аминокислот. Роль ЦСМ в регуляции КОС.
1.3 Врожденные дефекты ферментов ЦСМ, основные клинические проявления.
1.4 Пути вступления аминокислот в ЦТК (схема). Глико- и кетогенные аминокислоты.
Практическая часть
2.1 Решение задач.
2.2 Лабораторная работа.
Задачи
1 В какие из соединений превращаются при окислении сер, ала и цистеин:
а) a-кетоглутарат; б) пируват; в) фумарат; г) сукцинат; д) цитрат; е) ни в одно из указанных?
2 Биосинтез мочевины наиболее активен в:
а) почке; б) скелетной мышце; в) печени; г) тонкомкишечнике; д) мозге; е) миокарде?
3 Аммоний в моче образуется:
а) под действием глутаминазы на глутамин;
б) при окислении аминокислот L-аминооксидазо;
в) при окислении аминов аминооксидазо;
г) дезаминированием аспартата аспартатаммиаклиазо;
д) под действием аспарагиназы на аспараги;
е) из карбамоилфосфата в условиях ацидоза?
4 Коэнзимы, участвующие в реакциях трансаминирования, образуются из витаминов:
а) PP; б) B6; в) B2; г) B1; д) B12; е) U?
5 Какие аминокислоты являются одновременно кето- и глюкогенными:
а) лей; б) вал; в) арг; г) гис; д) лиз; е) ала?
6 Через какие интермедиаты арг, гис, про вступают в ЦТК?
а) цитрат; б) сукцинат; в) фумарат; г) пируват; д) оксалоацетат; е) a‑кетоглутарат?
7 Какие ферменты участвуют в ЦСМ:
а) глутаминаза; б) уреаза; в) аргининсукцинатлиаза; г) ацетилорнитиназа; д) аргиназа; е) аспартатаммиаклиаза?
8 Прямым донором азота мочевины являются:
а) орнитин; б) мет; в) асп; г) глу; д) креатинин; е) глн?
9 Биосинтез глюкозы из асп включает реакции:
а) дефосфорилирования; б) гидролиза; в) гидроксилирования; г) дезаминирования; д) трансаминирования; е) оксидо-редукции; ж) изомеризации; з) карбоксилирования?
10 Какие из соединений могут образоваться из ала при трансаминировании:
а) a-кетоглутарат; б) глу; в) асп; г) ацетил-КоА; д) пируват; е) глн?
11 Глутаминазная активность почек при ацидозе:
а) возрастает; б) снижается; в) не изменяется?
12 Объясните механизм участия ЦСМ в реакциях КОС при ацидозе:
а) активируется для удаления аммиака;
б) активируется для удаления кислот;
в) тормозится для сохранения HCO3-;
г) уменьшает потерю воды;
д) обеспечивает регенерацию асп;
е) все вместе.
13 Кетогенные аминокислоты:
а) дают положительную реакцию на кето-группу;
б) участвуют в реакциях кетогенеза;
в) снижают содержание кетоновых тел в крови;
г) увеличивают содержание кетоновых тел в крови;
д) активируют цикл Кребса;
е) активируют протеолиз;
ж) превращаются в кетокислоты;
з) ингибируют протеолиз;
и) являются заменимыми;
к) являются незаменимыми?
14 Глутамат, доставляемый кровью в ткань мозга, превращается там в глутамин, который можно обнаружить в оттекающей от мозга крови. Каков смысл этого метаболического превращения?
15 Объясните антигипоксический, защитный эффект глутамата, назначаемого при истощении, утомлении, интоксикации и др. экстремальных ситуациях.
16 Альбумин сыворотки крови здорового человека составляет 56 % от уровня общего белка, величина последнего – 74,2 г/л. Определите величину белкового коэффициента и объясните его клинико-диагностическое значение.
Лабораторная работа. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и в моче
Принцип метода. Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа комплекс красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины.
Меры предосторожности по ходу работы. Обращаться с осторожностью, т. к. реактив 2 содержит ядовитое вещество тиосемикарбазид, а в рабочем растворе содержится серная кислота.
Ход работы. Осуществляется в соответствии с таблицей 1.
Таблица 1
| Реагент | Проба | Эталон | Контр. раствор |
| Сыворотка или разведенная моча | 0,01 | - | - |
| Реактив 1 | - | 0,01 | - |
| Дистиллированная вода | - | - | 0,01 |
| Реактив 2 | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
В пробирку отмеривают 0,01 мл сыворотки крови или разведенной мочи, добавляют 2 мл рабочего раствора (реактива 2), содержащего смесь раствор диацетилмонооксима, тиосемикарбазида и хлорида железа в кислой среде.
Эталонную пробу обрабатывают точно так же, используя вместо 0,01 мл сыворотки крови 0,01 мл эталонного раствора мочевины (реактива 1).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, пробирки закрывают алюминиевой фольгой и помещают точно (!) на 10 мин в кипящую баню.
Затем пробирки быстро охлаждают в токе холодной воды и не позднее (!) 15 мин после охлаждения, измеряют оптическую плотность пробы (A1) и эталона (A2) против контрольного раствора (реактив 2) в кювете 10 мм при длине волны 490–540 нм (зеленый светофильтр).
Мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 100, а результат умножается на коэффициент разведения.
Расчет:
[Мочевина] = 16,65(А1/А2)(моль/л).
Норма. 2,5–8,3 ммоль/л.
Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
Предупреждение. При содержании мочевины в пробе свыше 23 ммоль/л пробу следует развести дистиллированной водой, анализ провести повторно, а полученный результат умножить на коэффициент разведения.
При определении мочевины в гемолитических или липемических сыворотках пробу необходимо депротеинировать 5 %-ным раствором ТХУ. Для этого в пробирке смешивают 0,1 мл пробы с 1 мл раствора ТХУ и центрифугируют. Точно так же разбавляют и эталонный раствор мочевины. Для собственно анализа отмеривают 0,1 мл надосадочной жидкости. Далее определение проводят как при анализе без депротеинирования. Таким же способом можно анализировать цельную кровь.
Клинико-диагностическое значение. На долю мочевины приходится половина остаточного азота крови, именно та часть, которая в наибольшей степени задерживается в крови при нарушении функции почек. При патологии почек уровень мочевины в крови нарастает гораздо быстрее, чем остальных компонентов остаточного азота. К тому же определение уровня мочевины в крови технически проще осуществимо, чем остаточного азота. В связи с этим уровень ее в крови, прежде всего, характеризует экскреторную функцию почек.
Повышение содержания мочевины в крови отмечается у больных с другими патологическими состояниями – рефлекторной анурией, обструкцией (камни и злокачественные новообразования) в мочевыводящих путях, усиленным распадом белка (острая желтая атрофия печени, тяжелые инфекционные заболевания, обширные травмы и др.).
Верхняя граница содержания мочевины в сыворотке крови зависит от характера питания. При приеме белков в сутки свыше 2,5 г/кг веса уровень мочевины может возрастать до 10 ммоль/л.
Снижение уровня мочевины в крови наблюдается редко и отмечается обычно при дефиците белка в рационе. При беременности также возможно снижение концентрации мочевины в крови ниже 3,33 ммоль/л.
Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
Рекомендуемая литература
Основная
1 Материал лекций.
2 Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 337–354; 1998. С. 428–451.
3 Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 313–327, 335–336.
Дополнительная
4 Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 259–272.
5 Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 255–258.
6 Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 2. С. 571–599.
7 Врожденные и приобретенные энзимопатии / Под ред. Т. Ташева. М.: Медицина, 1980. С. 126–129.
8 Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. М.: Медицина, 1981. С. 592–595.
Занятие 20
Особенности обмена аминокислот в норме
и при патологии
Цель занятия: сформировать представления об особенностях обмена отдельных аминокислот (АК) в норме и при патологии. Дать биохимическое обоснование практического применения аминокислот в медицине. Освоить методику определения активности трансаминаз в сыворотке крови.
