Схематичное представление теории Кошланда
Лекции.Орг

Поиск:


Схематичное представление теории Кошланда




 

1.3 СПЕЦИФИЧНОСТЬ АМИЛАЗЫ

Ферменты обладают очень высокой специфичностью. Эта специфичность обусловлена особой формой молекулы фермента, точно соответствующей форме молекулы субстрата. Эту гипотезу называют гипотезой “ключа и замка”: субстрат сравнивается в ней с ключом, который точно подходит к замку, т.е. к ферменту. Далее на основании этой гипотезы уже в 1959 году новую интерпретацию гипотезы “ключа и замка” предложил Кошланд. Он делает вывод о гибкости активных центров ферментов. Согласно этому предположению, субстрат соединяясь с ферментом, вызывает изменения в структуре последнего. Подходящей аналогией в этом случае может служить перчатка, которая при надевании на руку соответствующим образом изменяет свою форму.

Амилазы различного происхождения имеют много общих свойств: хорошо растворяются в воде или в сильно разбавленных растворах солей. Более концентрированные растворы солей (например 20-30% - ные растворы сульфата аммония) вызывают осаждение этих ферментов. Амилаза легко растворяются в разбавленных растворах этилового спирта, но осаждаются при его концентрации в среде свыше 60%. Белок амилаз обладает слабокислыми свойствами; изоэлектрическая точка ферментов колеблется в пределах рН 4,2 - 5,7. Молекулярная масса солодовой амилазы 60000, амилаз микроскопических грибов - 45000-50000. Многие из амилазы получены либо в высокоочищенном, либо в кристаллическом виде. Ионы кальция оказывают стабилизирующее действие на амилазу. Это впервые было обнаружено Воллерштейном, затем подтверждено Накамурой. В настоящее время это явление отмечено почти для всех амилаз. Однако теоретически этот вопрос применительно к промышленному гидролизу крахмала до сих пор не разработан.

9 вопрос

Д л я о п р е д е л е н и я к о л и ч е с т в а б е л к а в о б р а з ц е и с п о л ь з у е т с я р я д м е т о д и к :

1.Биуретовый метод

2.Микробиуретовый метод

3.Метод Бредфорда

4.Метод Лоури

5.Спектрофотометрический метод

Б и у р е т о в ы й м е т о д.Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков.

Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.

М и к р о б и у р е т о в ы й м е т о д основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса, образующегося в результате взаимодействия пептидных связей с Cu2+ в щелочной среде. К 0,2 мл ПМ лимфоцитов, сыворотки или плазмы добавляли 3,5 мл раствора NаОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Выдерживали 15 мин при комнатной температуре и спектрофотометрировали на СФ — 46 при 330 нм. Построение калибровочного графика проводили по стандартному раствору белка.

М е т о д Б р э д ф о р д а один из наиболее популярных методов, используемый для определения концентрации белка в растворе. Метод определения концентрации белка по Брэдфорд успешно используется в случае измерения растворов с низкой концентрацией белка и растворов, содержащих компоненты, также обладающие значительным поглощением при 280 нм. Метод определения концентрации белка по Брэдфорд, так же, как и метод Лоури и BSA, требует построения стандартной калибровочной кривой перед измерением концентрации неизвестного белка.

Универсальность метода и его гибкость позволяют создавать модификации процедуры измерений для различных целей и типов измерений.

Метод Брэдфорд основан на сдвиге спектра поглощения кумасси (Coomassie Blue) в сторону значений 595 нм прямо пропорционально концентрации содержащегося в растворе белка. Кумасси образует комплекс с белком; этот комплекс измеряют при длине волны 595 нм. абсорбционная фотометрия комплекса кумасси / белок имеет очень высокую чувствительность и эффективна даже в случае следовых концентраций белков.

М е т о д Л о у р и. Метод количественного определения белка, основанный на измерении концентрации окрашенных продуктов, образующихся в результате сочетания двух химических реакций: биуретовой реакции на пептидную связь и взаимодействия реактива Фолина-Чокалтеу с ароматическими аминокислотами.

С п е к т р о ф о т о м е т р и ч е с к и й м е т о д. Спектрофотометрия (абсорбционная) — физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины волны. Спектрофотометрия широко применяется при изучении строения и состава различных соединений (комплексов, красителей, аналитических реагентов и др.), для качественного и количественного определения веществ (определения следов элементов в металлах, сплавах, технических объектах).





Дата добавления: 2015-05-05; просмотров: 429 | Нарушение авторских прав | Изречения для студентов


Читайте также:

Рекомендуемый контект:


Поиск на сайте:



© 2015-2020 lektsii.org - Контакты - Последнее добавление

Ген: 0.003 с.