Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


Ќепр€мые иммуноанализы

Ќепр€мые методики (рис. 4.10) примен€ют чаще, чем пр€мые.

Ќепр€мым иммуноанализом называют анализ, в котором метку присоедин€ют не к целевому антигену и не к антителу против целевого антигена, а к так называемым вторым антителам - антивидовым антииммуноглобулиновым антителам, т.е. антителам к иммуноглобулинам того вида животных или человека, с биологическим материалом которого работают.

–ис. 4.10. ѕринцип непр€мых иммуноанализов

“аким образом, один и тот же препарат конъюгата антиглобулиновых антител с ферментом используют в качестве про€вл€ющего стандартного реагента в разных тест-системах дл€ определени€ различных конкретных антигенов или антител.

¬место антивидовых антиглобулиновых антител дл€ конъюгации с ферментом может быть использован, например, протеин ј стафилококка, который по своей природе с высокой аффинностью св€зываетс€ с иммуноглобулинами класса G некоторых видов млекопитающих, включа€ человека. ¬се описанные схемы постановки пр€мого варианта »‘ј (конкурентный, ингибиторный, Ђсэндвичї, иммунометрический) примен€ют и в непр€мом варианте.

Ќепр€мые варианты »‘ј не требуют очистки искомых антигенов или антител. „истым должен быть только препарат антивидовых антииммуноглобулиновых антител.

¬ качестве ферментов-меток в »‘ј используютс€ следующие ферменты и субстраты дл€ них.

1. ѕероксидаза из корней хрена, субстраты:

Х орто-фенилендиамин (продукт желто-коричневый, растворимый, поглощает при 492 нм);

Х 3,3'-диаминобензидин (продукт коричневый, нерастворимый);

Х 3-амино-9-этилкарбазол (продукт красный; нерастворимый);

Х 5-аминосалицилова€ кислота (продукт коричневый, растворимый, поглощает при 405 нм);

Х 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин)-6-сульфонова€ кислота (продукт зеленый, растворимый, поглощает при 405 нм);

 

Х 4-хлоро-1-нафтол(продуктголубой,нерастворим);3,3'-диметокси- бензидин (продукт желто-оранжевый, растворимый, поглощает при 405 нм);

Х 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (продукт голубой, растворимый, поглощает при 450 нм);

Х ABTS - 2,2'-азино-ди(3-этилбензтиазолин)-6-сульфонова€ кислота.

2. β-√алактозидаза (субстраты - дериваты β-галактозида, например 4-метилумбелиферил-β-D-галактозин).

3. ўелочна€ фосфатаза (субстраты: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, продукт голубой, нерастворимый; р-нитрофенил фосфат, продукт желтый, растворимый, поглощает при 405 нм).

4. реаза (субстрат - мочевина в комбинации с бромкрезолом пурпурным, продукт образуетс€ очень быстро, пурпурного цвета, растворимый, поглощает при 590 нм).

Ќерастворимые продукты ферментативных реакций используют в методах иммуногистохимии и иммуноблота, растворимые - в иммуноферментных анализах, в которых результат регистрируют количественно спектрофотометрически.

¬стречаютс€ оригинальные разработки с использованием других (кроме вышеперечисленных) ферментов-меток.

≈сли по тем или иным биохимическим причинам заданный антиген или интересующее антитело не удаетс€ конъюгировать с меткой без существенных потерь в аффинности их св€зывани€, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты. Ќапример, нередко используют так называемое Ђавидинбиотиновоеї взаимодействие. јвидин - белок, выдел€емый из Ђбелкаї куриных €иц, биотин - витамин Ќ (он же кофермент R). јвидин по своей природе с высокой аффинностью (Kd ~ 10-15 M) св€зывает биотин. Ѕиотин легко конъюгируетс€ с флюоресцеином.  роме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные моноклональные антитела (существуют коммерческие

 

препараты). —оответственно все эти дополнительные компоненты используют при необходимости в конструкци€х тест-систем, предназначенных дл€ детекции того или иного заданного вещества. —ходным по аффинности сродством к биотину обладает также белок стрептавидин, выдел€емый из грибов Streptomyces avidinii.

¬ конкретных вариантах тест-систем используют разные буферные растворы, соответствующие свойствам конкретных антигенов, ферментов и их субстратов. ƒл€ примера мы опишем последовательность действий и используемые реагенты при выполнении непр€мого твердофазного иммуноанализа, его простой и часто встречающийс€ вариант, подход€щий, в частности, дл€ определени€ специфических противовирусных антител как маркера наличи€ в организме той или иной вирусной инфекции (специфическую лабораторную диагностику вирусных инфекций примен€ют дл€ вы€влени€ инфицированности ¬»„, вирусами гепатитов, герпеса, цитомегаловирусами и др.).



<== предыдуща€ лекци€ | следующа€ лекци€ ==>
—эндвичї-»‘ј. Ђ—эндвичї-»‘ј (рис. 4.8) разработан дл€ антигенов, на которых есть не менее двух неперекрывающихс€ эпитопов. ѕротив обоих эпитопов получают в качестве | “вердофазный непр€мой иммуноферментный анализ
ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-02-12; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 517 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

—туденческа€ общага - это место, где мен€ научили готовить 20 блюд из макарон и 40 из доширака. ј майонез - это вообще десерт. © Ќеизвестно
==> читать все изречени€...

794 - | 731 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.012 с.