Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ћетоды выделени€, культивировани€ и идентификации микроорганизмов




¬ естественных услови€х микроорганизмы существуют в смешанных попул€ци€х, ассоциаци€х и пр. ƒл€ установлени€ этиологического фактора инфекционного заболевани€ бактериологическим методом, требуетс€ выделение микроба в чистом виде. ƒл€ этого примен€ют различные питательные среды из перечисленных выше групп (транспортные, обогащени€, элективно-диагностические, дифферернциально-диагностические и пр.) в определенном пор€дке.

¬начале делают посев исследуемого материала (кровь, фекалии, моча, соскобы розеол, мокрота, носоглоточные смывы и пр.) после определенной его обработки как обычно на среды обогащени€ и элективно-диагностические (при необходимости перемещени€ посевов на большие рассто€ни€ примен€ют среды консервировани€). «асе€нные питательные среды выдерживают при температуре, оптимальной дл€ данного микроба (обычно в термостате при 370 —).

ѕосле экспозиции просматривают чашки ѕетри и выбирают подозрительные колонии (по цвету, форме, размеру, кра€м колонии и пр. - это диагностические признаки), которые пересевают на скошенный агар, с целью получени€ чистой культуры в достаточном дл€ дальнейшей работы количестве. —о скошенного агара делают пересев на дифференциально- диагностические среды.

ѕри исследовании на энтеробактерии ввод€т дополнительные элективные среды (ќлькеницкого и пр.), откуда делают пересевы на дифференциально-диагностические среды, с целью определени€ свойств выделенной культуры: ферментативных, протеолитических, бродильных, токсигенных и других, что €вл€етс€ основой в определении вида, подвида и др. качеств исследуемой культуры.

“ака€ схема выделени€ микроба и идентификации может длитьс€ 3-4 дн€ или более в зависимости от вида микроба (свойств).  онечным результатом €вл€етс€ выделение штамма и установление его вида, а возможно Ц серовара, фаговара, антибиотикочувствительности и пр., т.е. проводитс€ не только постановка этиологического диагноза, но и даютс€ некоторые рекомендации дл€ лечени€ конкретных инфекционных больных.

„иста€ культура - это потомство одной микробной клетки, выращенное на питательной среде, т.е. культура моноклона.

Ўтамм - это чиста€ культура определенного вида микроба, выделенна€ в данное врем€ из конкретного материала.

¬ид Ц это категори€, обозначающа€ микроорганизмы, имеющие сходный генотип и несколько различающиес€ по фенотипу.

–од - это собирательный термин, обозначающий сходные по генотипу и несколько различающиес€ по фенотипу (свойствам) микроорганизмы нескольких видов.

ƒл€ культивировани€ микроорганизмов необходимы не только питательные среды, но и услови€ изол€ции пассируемых микробов от загр€знени€.

Ёто достигаетс€ стерильными услови€ми культивировани€.

ѕосев инокул€та

¬ бактериологической практике нет малозначащих этапов, которые можно исполнить небрежно. ƒл€ конечного результата €вл€етс€ очень важным: как и в какие сроки был вз€т материал дл€ исследовани€ и где он был засе€н (у постели больного или в лаборатории).

≈сли материал перевоз€т в лабораторию, то важно в какие сроки он будет доставлен, каким образом и когда будет сделан посев.

ƒл€ каждой инфекции существует инструктивно-методическа€ литература по режиму и срокам доставки, способам забора материала и пр.

ѕервым этапом бактериологических исследований €вл€етс€ посев исследуемой пробы на элективно-диагностические и среды обогащени€. ѕитательные среды следует выбирать в зависимости от предполагаемых возбудителей и от типа материала (кровь, фекалии и пр.).

ѕосев провод€т петлей (материал нанос€т у кра€ чашки, затем рассеивают по секторам), шпателем (материал нанос€т на поверхность агара, а затем стекл€нным или металлическим шпателем тщательно втирают его в поверхность среды), тампоном (тампон с материалом внос€т в чашку, делают площадку и круговыми движени€ми чашки и тампона втирают материал в поверхность среды) и пр.

ƒл€ разных целей посевы, например, делают штрихами.  арандашом расписывают сектора на дне чашки и в каждом секторе посевы делают от кра€ чашки к середине штрихами, которые не должны перекрещиватьс€ (обычный посев). »ногда делают посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидка€ бульонна€ культура) нанос€т пипеткой на агар и тщательно распредел€ют по всей поверхности, покачива€ чашку. Ќадписи делают на чашках со стороны дна.

ѕри пересеве из пробирки в чашку ѕетри, вначале берут пробирку с материалом в левую руку между указательным, большим и средним пальцами, положив ее на ребро кисти. ѕетлю берут в правую руку как "писчее перо", прокаливают и после остужают внутри пробирки. ѕробку пробирки зажимают между мизинцем и ладонной поверхностью кисти правой руки и вынимают на огнем спиртовки, обжига€ кра€ пробирок. ¬вод€т петлю внутрь пробирки, прикасаютс€ к краю питательной среды дл€ охлаждени€ петли, а затем набирают материал с поверхности среды, не поврежда€ агар.

«атем петлю с материалом вынимают из пробирки, быстро над огнем спиртовки закрывают пробирку пробкой и став€т ее в штатив, немного приподнимают крышку у чашки левой рукой, ввод€т внутрь чашки петлю, делают небольшую площадку, втира€ материал, а затем, поворачива€ чашку, засевают штрихами по секторам чашки. ѕетлю вынимают и быстро закрывают чашку, а петлю стерилизуют над огнем и став€т в штатив.

ѕри посеве из пробирки в пробирку, обе держат в левой руке наклонно, как описано выше. ѕетлю держат как обычно, прокаливают, затем одновременно вынимают пробки из обеих пробирок, как описано выше. ѕетлю ввод€т в пробирку с посевом, набирают культуру и вынимают, ввод€т в другую пробирку и производ€т посев штрихами от нижнего кра€ кос€ка к верхнему.

≈сли засевают в жидкую среду, то петлю держат некоторое врем€ в этой среде, чтобы культура могла распределитьс€ в жидкости.

ѕри посеве в полужидкий агар делают петлей укол в эту среду. «атем петлю вынимают, закрывают пробками обе пробирки над огнем, стерилизуют петлю и став€т в штатив, а затем став€т и пробирки.

ѕри посеве на скошенный агар, делают штрихи, начина€ с нижнего кра€ скошенного агара, с конденсационной воды (если она есть). ѕри посеве на среды –ессел€, ќлькеницкого и  лиглера после штрихов делают укол внутрь агара.

ѕри посеве жидкого материала пользуютс€ пипетками или петлей. ѕри посеве пробы дл€ количественного учета микроорганизмов нанос€т 1 мл материала пастеркой на чашку и шпателем втирают его в поверхность первой чашки, не прожига€ шпатель, перенос€т его во вторую чашку и также втирают, затем и в третью. Ћишнюю жидкость отсасывают из чашек пипетками.

ѕосевы инкубируют в термостате при 370 — (обычно) или при температуре, оптимальной дл€ культуры. —рок инкубации зависит от скорости делени€ клеток, например, бактерии кишечной группы обычно растут 18-24 ч, холерный вибрион на пептонной воде - 6 ч, другие микробы, например, лептоспиры - до 5-6 дней и т.д.

»зучение изолированных колоний

ѕо истечение определенного срока на засе€нных чашках микробы формируют колонии разной морфологии.

 олони€ - это видимое невооруженным глазом характерное скопление микроорганизмов, выросших на плотной питательной среде как потомство от одной из засе€нных микробных клеток.

Ёто второй этап бактериологического анализа. ћорфологи€ выросших колоний - это важный культурально-диагностический признак.  олонии микробов изучают в проход€щем свете с помощью лупы или невооруженным глазом. –ассматривают чашку со стороны дна.

ќценивают морфологию по определенным критери€м:

n размер колонии (микроскопический, мелкий, средний, гигантский),

n форма колоний (круглые, неправильные, отросчатые и пр.),

n профиль колоний (плоский, выпуклый, куполообразный, блюдцеобразный и пр.),

n характер поверхности (гладка€, шероховата€, морщиниста€, изрезанна€ и пр.),

n прозрачность колонии (прозрачна€, мутна€, полупрозрачна€),

n пигмент (желтый розовый красный, кремовый, перламутровый и пр.),

n структура колонии (гомогенна€, зерниста€, волокниста€ и пр.),

n кра€ колонии (ровные, фестончатые, изрезанные, волнистые, бахромчатые и пр.),

n консистенци€ колонии (м€гка€, суха€, слизиста€, сметанообразна€, крошковидна€),

n тип колонии (круглые, влажные, выпуклые Ц S-тип, сухие, шероховатые, кра€ неправильные Ц R-тип, т€гучие, слизистые, валик вокруг колонии Ц ћ-тип)

 

Ќа этом этапе часть колонии берут петлей дл€ приготовлени€ мазка. ѕри подтверждении однородности культуру засевают на скошенный агар дл€ накоплени€ и на некоторые среды.

ѕризнаки роста бактерий на жидкой питательной среде:

–ост бактерий на жидкой питательной среде оценивают по нескольким признакам:

1. Ќаличие пленки (сверху среды, пристеночна€ и пр.),

2. Ќаличие осадка (плотный, рыхлый, волокнистый и пр.),

3. Ќаличие помутнени€ среды,

4.  омбинаци€ этих признаков.

 

1. –авномерное помутнение жидкой питательной среды (Shigella и др.),

2. ѕридонный рост бактерий Ц осадок на дне. ќсадок может быть скудный, обильный, по виду Ц крошковидный, гомогенный, волокнистый, в виде рыхлых хлопьев, компактный (Cl. botulinum), зернистый (Corynebacterium), войлокообразный (Mycetes), в виде комочков ваты (Bacillus). ѕо консистенции Ц в€зкий, слизистый, хрупкий, пастообразный. ѕитательна€ среда над ним может быть: прозрачной (Bacillus) или мутной (Escherichia). ÷вет осадка среды определ€етс€ пигментами, продуцируемыми культурой. ѕридонный рост характерен дл€ анаэробов.

3. ѕристеночный рост бактерий. —реда прозрачна, а бактерии растут в виде пленки, хлопьев, зерен и пр., прикрепившись к внутренней поверхности стенок сосуда. —нимаетс€ с трудом или легко.

4. ѕоверхностный рост. Ётот тип роста характеризуетс€ наличием пленки или едва заметного налета.

а) пленка тонка€, нежна€, бесцветна€, едва заметна€,

б) пленка влажна€, толста€, хорошо видима€, в€зка€, слизиста€, прилипает к петле и т€нетс€ за ней,

в) пленка плотна€, суха€, напоминает кусочек кожи, снимаетс€ целиком в виде диска по диаметру пробирки,

г) пленка плотна€ суха€, сморщенна€ бородавчата€, разбиваетс€ на кусочки, которые погружаютс€ вглубь жидкости.

–ост бактерий в полужидком агаре

ѕодвижные микробы вызывают помутнение среды.

ќни распредел€ютс€ практически по всей толще среды.

Ќеподвижные бактерии растут по ходу укола петлей, образу€ разные по форме и размерам помутнени€ среды Ц в основном конической или цилиндрической формы с вариаци€ми.

ќкружающа€ среда всегда остаетс€ прозрачной.

ѕигменты микроорганизмов

÷вет колоний определ€етс€ пигментами, которые продуцируют микроорганизмы. ѕатогенные микробы, в основном, пигментов не образуют и в проход€щем свете колонии остаютс€ достаточно прозрачными.

ѕигментообразующие виды микробов придают колони€м разный цвет: фарфорово-белый, золотисто-оранжевый, красный, синий, сиреневый, черный, зеленый, коричневый и пр.

»звестны пигменты двух типов: растворимые в воде и растворимые в органических соединени€х. –астворимые в воде пигменты окрашивают среду (Pseudomonas aeruginosa). Ќаиболее распространены в природе такие пигменты как меланины, каротины, ксантофилы. ѕервые €вл€ютс€ нерастворимыми в воде пигментами, синтезирующимис€ из фенольных соединений. ќни защищают микробы от действи€ токсичных перекисных радикалов ќ2. ћногие пигменты бактерий обладают антимикробным действием.

ћеланиновые пигменты черного и коричневого цвета, продуцируютс€ бактеройдами.

’инолоновые пигменты дают желтый цвет, продуцируютс€ микобактери€ми, кокками.

ѕирроловые пигменты дают €рко-красный цвет, продуцируют Serratio marcescens.

»зучение биохимических свойств культур

Ѕиохимические свойства выделенной чистой культуры изучают на третьем этапе или последующем, в зависимости от результатов 2-го этапа.  ультуру, выросшую на скошенном агаре, провер€ют на чистоту путем микроскопировани€ мазка, окрашенного по √раму. ѕри этом, изучают морфологию клеток бактерий, их расположение и тинкториальные свойства. ѕри необходимости примен€ют другие специальные красители. ƒалее приступают к изучению биохимических и др. свойств чистой культуры, по возможности использу€ данные микроскопии.

ќпределение протеолитических свойств. —пособность выделенной культуры расщепл€ть белки протеолитическими ферментами изучают на средах с молоком, желатиной, пептоном, сывороткой и пр.

¬ процессе ферментации микробами пептонов, образуютс€ индол (C8H7N), сероводород (H2S), аммиак (NH3) и др. соединени€. ƒл€ обнаружени€ сероводорода после посева под пробку помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной уксуснокислым свинцом. ѕри выделении сероводорода бумага чернеет, ввиду образовани€ сернистого свинца (PbS).

»ндол определ€ют с помощью индикаторной бумажки, которую пропитывают гор€чим насыщенным раствором щавелевой кислоты (C2H2O4). ѕри выделении индола бумажка краснеет. ¬озможно его определение с помощью реактива Ёрлиха.

јммиак обнаруживают при помощи увлажненной красной лакмусовой бумажки. ѕри выделении аммиака бумажка синеет

–азжижение желатина учитывают при посеве уколом в столбик питательной среды. “е микроорганизмы, которые имеют соответствующий фермент, могут разлагать желатин, ѕри этом, разжиженный желатин может приобретать разнообразные формы (воронки, елочки и пр.).

ѕросветление молока (пептонизаци€) осуществл€ют микробы, разлагающие казеин. ћолоко просветл€€сь, приобретает вид молочной сыворотки.

ќпределение сахаролитических свойств микробов. Ёти свойства определ€ют на средах ’иса и др. ¬ их состав входит лактоза, глюкоза и др. углеводы. ћикробы, сбраживающие

какой-либо углевод, определ€ют за счет изменени€ окраски среды в пробирке (это учет образовани€ кислоты). √азообразование определ€ют по наличию растрескивани€ агара или пузырьков газа в толще полужидких сред и в поплавках в жидких средах.

ќпределение ферментов микробов. ћетаболические процессы в клетках микробов протекают с участием ферментов. ќпределенные микроорганизмы имеют индивидуальный

набор ферментов. — помощью ферментов коагулируетс€ плазма крови, может расщепл€етс€ соединительна€ ткань в организме и пр.

ѕриводим некоторые методы определени€ ферментов у бактерий, регистрируемые по конечному феномену, получаемому за счет расщеплени€ субстрата.

√емолизины - разрушают эритроциты, что про€вл€етс€ просветлением зоны вокруг колонии бактерий на кров€ном агаре.

ѕлазмокоагулаза - коагулирует плазму крови, что про€вл€етс€ по способности некоторых бактерий свертывать плазму в мелкие хлопь€.

√иалуронидаза - расщепл€ет NN св€зи в соединительной ткани, что про€вл€етс€ в опыте: в пробирку с культурой внос€т гиалуроновую кислоту и после 30 мин экспозиции при 370 — добавл€ют крепкой уксусной кислоты. ѕри наличии фермента бактерий гиалуронова€ кислота утрачивает способность образовывать сгусток.

” выделенных бактерий с установлением вида, определ€ют биовар, фаговар, серовар, хемовар и пр.

 ультивирование анаэробных бактерий

јнаэробы - это микроорганизмы с определенным типом метаболизма, исключающим использование кислорода. —пособы культивировани€, выделени€ и идентификации таких микроорганизмов существенно отличаютс€ от аэробных бактерий.

ѕитательные среды дл€ культивировани€ анаэробов:

1. јнаэробный кров€ной агар. √отовитс€ на основе кров€ного агара и среды 199 (10 % твин-80), 10 мкг гемина, 5 % цитратной крови и др. ингредиентов.

2. ∆елточный агар. ¬ среду на основе эритрит-агара добавл€ют 10 мкг гемина, 0,2 % глюкозы, 20 % суспензию €ичного желтка и др. ингредиенты. — помощью среды определ€ют лецитовителлазную и липазную активность анаэробов. ¬округ выросших колоний анаэробов образуетс€ зона помутнени€, а при наличии липазы - зона радужной блест€щей видимой при косом освещении опалесценции.

3. —реда дл€ контрол€ стерильности (— —).  оммерческа€ среда. »спользуетс€ дл€ транспортировки засе€нного материала и как среда обогащени€.

4. —реда  итта-“ароцци. √отов€т на основе бульона ’оттингера с добавлением кусков печени или м€са, разливаетс€ по пробиркам. »спользуют как среду накоплени€.

5. —реда ¬ильсона-Ѕлера. √отовитс€ на основе сахарного агара с добавлением 1 % натри€ сернокислого и 0,08 % хлорного железа. —реду разливают по пробиркам высоким столбиком. »спользуетс€ дл€ ускоренной диагностики газовой гангрены.

6. —ахарный агар. √отовитс€ на основе эритрит-агара с добавлением 1 % глюкозы.

—уществуют и другие питательные среды дл€ анаэробов.

јнаэробный тип метаболизма гораздо менее продуктивен во времени, чем у аэробов, поэтому культивирование анаэробов требует более богатых питательных сред в более высоких концентраци€х.

ћетоды создани€ анаэробных условий

 ультивирование анаэробов требует не только определенных питательных сред, но и условий их выращивани€. “акие услови€ создаютс€ разными способами:

’имические способы создани€ анаэробных условий:

1. ѕрименение щелочных растворов пирогаллола дл€ поглощени€ кислорода в среде.

2. √идросульфат натри€. ƒл€ св€зывани€ кислорода в 1 л объема берут 100 мл 20 % свежеприготовленного раствора Na2S2O4 и 16 мл 50 %  ќЌ. Ёта смесь работает лучше, чем пирогаллол.

3. ѕрименение газогенерирующих систем дл€ создани€ анаэробных условий в среде (анаэростаты, эксикаторы, прозрачные газонепроницаемые пластиковые пакеты) и пр.

Ѕиологические методы создани€ анаэробных условий:

1. —овместное выращивание анаэробов и аэробов (метод ‘ортнера). Ќа одну сторону чашки засевают исследуемый на анаэробы материал, а на другую - культуру аэроба, который способен энергично поглощать кислород. „ашку закрывают крышкой, а кра€ нужно залить парафином. ¬ качестве поглотител€ часто используют Serratia marcescens.

2. ѕомещают в питательную среду кусочки печени или других органов, клетки которых активно поглощают кислород.

ƒл€ более тщательного создани€ бескислородных условий используютс€ анаэростаты, заполн€€ их после отсасывани€ воздуха инертными газами.

¬ыделение чистой культуры анаэробов

ѕервичные посевы анаэробов делают в анаэробных услови€х на среду обогащени€ (— — или тиогликолева€ среда,  итта-“ароцци), после определенной экспозиции делают высев на плотные питательные среды: сахарный кров€ной агар, сахарный агар и др. ѕри по€влении роста делают пересев микробов на — — или  итта-“ароцци дл€ получени€ чистой культуры.

1. ћетод ÷ейсслера. »сследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной среды, помещают в анаэробные услови€ при 370 — на 24-72 ч.  олонии пересевают на среду дл€ контрол€ стерильности или  итта-“ароцци дл€ выделени€ чистой культуры.

2. ћетод ¬ейнберга. Ќесколько капель исследуемого материала внос€т в пробирку с 4-5 мл 0,85 % раствора хлорида натри€, перемешивают запа€нным капилл€ром и перенос€т в пробирку с охлажденным до 45-500 — сахарным агаром, разлитым высоким столбиком ѕосле перемешивани€ этим же капилл€ром последовательно, без промежуточной стерилизации капилл€ра, засевают еще 2 пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. ¬ыросшие через 24-72 ч в глубине агара изолированные колонии засевают на — — или  итта-“ароцци.

3. ћетод ѕеретца. √отов€т разведени€ исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром, дл€ чего разливают его по высоким столбиком. ¬ первую пробирку внос€т 3-4 капли исследуемого материала, перемешивают запа€нным капилл€ром и не стерилизу€ перенос€т его в другие пробирки. —одержимое пробирок выливают в соответствующие чашки ѕетри, на дне которых лежит стекл€нна€ пластинка 6х6 см. —реду заливают так, чтобы она попала между пластинкой и дном чашки. ѕри по€влении роста бактерий пластинку удал€ют, а колонии пересевают на указанные выше среды.

4. ћетод ¬айона-¬инь€ла. √отов€т разведени€ исследуемого материала как указано выше в пробирках с сахарным агаром. ѕастеровской пипеткой насасывают из каждой пробирки материал, после чего концы пипеток запаивают. ѕосле получени€ роста бактерий пипетку разламывают и перенос€т в — — или в  итта-“ароцци.

5. –азновидность метода ѕеретца. ћатериал засевают вместе с сахарным агаром на крышку чашки ѕетри и закрывают донышком чашки. ўель между их кра€ми заливают парафином.

ћетоды культивировани€ грибов

√рибы - это аэробы или факультативные анаэробы. ƒл€ их культивировани€ используют специальные среды - —абуро΄, сусло-агар, овощные среды (картофельные, морковные и пр.) и др.

—реда —абуро′:

1. агар - 20,0 г

2. пептон - 10,0 г

3. мальтоза (глюкоза) - 40,0 г

4. вода дистиллированна€ - до 1000 мл.

5. стерилизаци€ в автоклаве 10 мин при 1200 —, рЌ довод€т до 5,6-6,0.

¬ыбор среды провод€т, ориентиру€сь на предполагаемый вид изучаемых грибов, например, дерматофиты лучше растут на агаре —абуро′, плесени - на среде „апека-ƒокса., кандиды - на среде √ородковой и др.

ƒл€ получени€ зрелых колоний грибов требуетс€ выращивание их в течение двух-трех недель (кроме дрожжей). ћакроморфологию колоний изучают невооруженным глазом и при малом увеличении микроскопа. ”читывают цвет, форму, консистенцию, кра€ и пр. качества колонии. ƒалее готов€т препарат дл€ микроскопии, дл€ чего часть мицели€ берут петлей и осторожно перенос€т на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют. ”читывают расположение мицели€, конидиеносцев, расположение спор и пр.





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-05-07; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 2648 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

“ак просто быть добрым - нужно только представить себ€ на месте другого человека прежде, чем начать его судить. © ћарлен ƒитрих
==> читать все изречени€...

728 - | 558 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.062 с.