Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


‘еномен агглютинации

ѕр€мой метод. Ёто процесс взаимодействи€ гомологичных антител и клеток (тканей, микроорганизмов, эритроцитов, тромбоцитов и пр.) с последующим выпадением комплекса в осадок (агглютинат).

ƒл€ постановки –ј-реакции агглютинации необходимо:

1. –астворитель- 0,85 % раствор хлорида натри€.

2. »звестную 2 % бактериальную взвесь.

3. »сследуемую сыворотку.

4. ѕредметные стекла, бактериологические петли, спиртовку.

5. »сследуема€ культура.

6. Ќаборы агглютинирующих сывороток. –еакци€ агглютинации ставитс€ в двух вариантах: в развернутом виде в пробирках и в виде ориентировочного метода Ц капельно на предметном стекле.

1. –азвернутый вариант –ј.

¬ насто€щее врем€ реакци€ не примен€етс€.

2.  апельный вариант –ј.

ѕримен€ют дл€ быстрого определени€ антител в сыворотке крови путем постановки –ј на предметном стекле при известном диагностикуме или типировании чистой культуры микробов при известной антисыворотке.

“ипирование культуры: на предметное стекло нанос€т каплю известной сыворотки в разведении 1:10 (или по инструкции) и отдельно - каплю растворител€. ¬ первую каплю внос€т бактериальной петлей типируемую культуру микроба и распредел€ют ее по капле.

ѕетлю прожигают на спиртовке и вновь набирают культуру, распредел€€ ее во второй капле. ѕетлю прожигают и став€т на место. „ерез несколько минут провод€т учет результатов.

≈сли типируема€ культура гомологична по специфичности антителам в сыворотке, то будет наблюдатьс€ агрегаци€, т.е. образование в капле хлопьев Ц это положительный результат.

ѕри определении антител, также делают две капли: одна из исследуемой сыворотки, а втора€ Ц 0,85 % раствор хлорида натри€. ¬ обе капли внос€т по 1 капле бактериального диагностикума (1 млрд взвесь). „ерез несколько минут будет про€вление результатов ориентировочной –ј. ¬ случае присутстви€ в исследуемой сыворотке антител, которые гомологичны диагностикуму, будет наблюдатьс€ хлопьеобразование (это положительный результат). ѕри отрицательном результате (отсутствие антител в исследуемой сыворотке) обе капли остаютс€ равномерно мутными.

Ќепр€мой метод. ¬виду значительного многообрази€ диагностикумов (латексных, эритроцитарных,  о-, и др.), их необходимо классифицировать.

–азличи€ диагностикумов определ€ютс€ природой иммунологически активного агента, нагруженного на нерастворимый носитель.

ƒиагностикумы

 

иммуноглобулиновыеантительные антигенные

белковыенебелковые

 

ƒиагностикумы предназначены дл€ вы€влени€ антигена и определени€ антител в различных выделени€х человека, а также в биологических жидкост€х с помощью простых и сложных иммунологических реакций.

1. –Ќ√ј - реакци€ непр€мой гемагглютинации.

ƒл€ постановки реакции необходимо иметь:

1. ƒиагностический препарат.

2. –астворитель - 0,85 % раствор хлорида натри€, содержащий 2 % фосфатного буфера, рЌ 7,2 и нормальную лошадиную сыворотку в объеме 0,4 %.

3. ѕолистироловые панели, микропластины типа “акачи, градуированные пипетки, колбы, флаконы, пробирки, штативы.

4. »нактиватор дл€ исследуемых сывороток.

5. ‘ормалинизированные эритроциты барана, 50 % взвесь.

ѕостановка –Ќ√ј. Ёто двухкомпонентна€ реакци€, осуществл€етс€ в 2 вариантах: в полистироловых панел€х (макровариант), в микропластинах типа “акачи (микровариант).

1. ћакровариант.

ѕостановка реакции осуществл€етс€ в 2 этапа.

1 этап. √отов€т как обычно последовательные разведени€ сыворотки крови пациента в объеме 0,5 мл в лунках полистиролового планшета. ƒл€ этого во все лунки одного р€да планшета внос€т растворитель по 0,5 мл, а в первую лунку 0,5 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50. »з первой лунки 0,5 мл смеси перенос€т во вторую лунку, перемешивают и 0,5 мл перенос€т в третью и т.д. ѕоследнюю лунку оставл€ют контрольной (без сыворотки). —ыворотку можно переносить пипеткой или дозатором на 0,5 мл.

2 этап. јнтигенный эритроцитарный диагностикум (јЁƒ) добавл€ют во все лунки по 0,5 мл 0,5 % взвеси или по инструкции. ”чет результатов через 1,5- 2,0 ч (см. таблицу є 17).

2. ћикрометод. √отов€т последовательные разведени€ исследуемой сыворотки в объеме 0,05 мл в микропланшете типа “акачи, как указано раньше. ѕеренос 0,05 мл по лункам осуществл€етс€ дозатором или смесителем с объемом головки на 0,05 мл. ѕоследн€€ лунка - контроль. ¬о все лунки внос€т по одной капле (0,025 мл) 0,5 % диагностикума. ”чет реакции гемагглютинации через 1,5- 2,0 ч.

¬ первом и во втором случа€х вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавл€ть антительный эритроцитарный диагностикум (ј“Ёƒ).

“аблица є 17.

—хема постановки развернутого варианта –Ќ√ј

»нгредиенты Ќомера лунок и количество ингредиентов, в мл
                   
»сследуема€ сыворотка, 1:50 1,0 - - - - - - - - -
–астворитель - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
ѕолученные разведени€ 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 -
јЁƒ, 5 % взвесь 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0.025 0,025 0,025 0,025 0,025
–езультат –Ќ√ј ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + - -
“итр –Ќ√ј “итром –Ќ√ј €вл€етс€ разведение сыворотки 1:3200

 

¬ первом и во втором случа€х вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавл€ть антительный эритроцитарный диагностикум (ј“Ёƒ).

–езультаты –Ќ√ј учитывают по следующей схеме:

1. јгглютинат на ++++. Ёритроциты покрывают все дно лунки широким "зонтиком".

2. јгглютинат на +++. Ёритроциты покрывают почти все дно лунки.

3. јгглютинат на ++. ќсадок небольшой, в центре лунки.

4. јгглютината на дне нет или он в виде маленькокого колечка. Ёто отрицательный результат.

јгглютинат в виде зонтика получаетс€ при положительном результате, когда антитела исследуемой сыворотки вступ€т в реакцию с антигенным диагностикумом. ≈сли в сыворотке антител нет, то во всех лунках будет отрицательна€ реакци€ в виде маленького колечка.

— помощью –Ќ√ј можно определ€ть до 15 тыс клеток (чумный микроб), до 1 млн клеток (эшерихии, протей и пр.) и более микробных тел или от 0,01 до 0,0001 мкг в мл растворимого антигена. Ќедостаток метода: из всей массы активных антител или антигенов определ€етс€ только их часть, так называемые полноценные или агглютинирующие. –Ќ√ј разработали в 1945 г. ћиддлебрук и ƒюбо.

 апельную постановку –Ќ√ј провод€т в соответствии с описанной дл€ –ј, исключа€ типирование, диагностикум примен€ют не бактеральный, а јЁƒ.

–еакци€  о-агглютинации (– ој).

»звестна возможность поверхностного белка ј золотистого стафилококка штамма Covan 1 соедин€тьс€ с сайтом на Fc-фрагменте IgG человека, морской свинки и др. ѕри этом Fab-фрагменты IgG с активным центром антител €вл€етс€ свободным и доступным дл€ взаимодействи€ с микробами, токсинами и пр. “аким образом, получают направленный антительный диагностикум, поскольку в остальных случа€х приготовлени€ диагностикумов антитела будут располагатьс€ на носителе неупор€доченно.

—уточную культуру штамма Covan 1 смывают с агара 0,85 % раствором хлорида натри€ и дважды отмывают путем центрифугировани€ при 3000 об. в мин в течение 15 мин, довод€ взвесь бактерий до 10 %. ‘иксируют и убивают клетки путем кип€чени€ 1 мин.

  объему 10 % взвеси стафилококка добавл€ют равный объем иммунной сыворотки в разведении 1:20, специфичной к определ€емому агенту в исследуемом материале (например, шигеллам зонне), истощенной (адсорбируемой) взвесью стафилококка сапрофита, с целью удалени€ антистафилококковых антител. —месь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и дважды отмывают при центрифугировании. ќсадок стафилококка следует ресуспендировать, а затем консервировать азидом натри€ до 0,1 %. “аким образом, был приготовлен антительный  о-диагностикум.

Ќа предметное стекло нанос€т две капли: перва€ капл€ - этоиспытуемый на шигеллы зонне копроэкстракт, а втора€ капл€ Ц 0,85 % раствор хлорида натри€. ¬ обе капли внос€т по 1 капле приготовленного  о-диагностикума. ¬ течение 40-60 сек по€вл€ютс€ хлопь€ (это положительна€ реакци€ в случае присутстви€ в материале шигелл зонне). ¬ контроле будет равномерна€ муть. ¬ случае отсутстви€ шигелл зонне (в нашем примере), то в опыте будет така€ же равномерна€ мелкодисперсна€ муть, как и в контроле.

“орможение метода. Ёто сложные двухэтапные, многокомпонентные реакции.

–“√ј - реакци€ торможени€ гемагглютинации.

Ёта реакци€ относитс€ к торможению пр€мой группы реакций, примен€етс€ в основном в вирусологии и также относитс€ к феномену нейтрализации, где она и будет описана.

–“Ѕј - реакци€ торможени€ бактериальной агглютинации.

–еакци€ не примен€етс€.

–“Ќ√ј 1 - реакци€ торможени€ непр€мой гемагглютинации 1. (—инонимы: –Ќјг - если диагностикум антительный, –Ќјт - если диагностикум антигенный).

ћетод выполн€ют в 4 этапа.

1 этап. ѕредварительно выбирают рабочую дозу антисыворотки, путем постановки обычной –Ќ√ј с јЁƒ. ќпредел€ют титр данной антисыворотки (максимальное разведение, дающее положительный результат с јЁƒ). ¬ качестве рабочей дозы используют разведение, которое в 3-4 раза концентрированнее, чем титр –Ќ√ј.

2 этап. √отов€т последовательные разведени€ исследуемого материала на антиген как обычно, в объеме 0,25 мл в количестве 6 лунок в полистироловых панел€х, оставл€€ шестую лунку контролем дл€ диагностикума. ¬ контрольный р€д вместо исследуемого материала внос€т растворитель.

3 этап. «атем во все лунки двух р€дов внос€т антисыворотку к предполагаемому антигену в объеме 0,25 мл в рабочей дозе. —месь встр€хивают и оставл€ют на 30 мин при комнатной температуре.

4 этап. ѕосле экспозиции во все лунки добавл€ют по одной капле 5 % взвеси антигенного эритроцитарного диагностикума, гомологичного по специфичности антисыворотке. ѕанель встр€хивают и оставл€ют на 1,5-2,0 ч при комнатной температуре. ¬ случае присутстви€ в материале антигена происходит нейтрализаци€ в лунки антител известной антисыворотки, где антиген еще в значительной концентрации. ¬ этих лунках будет отрицательной реакцией (таблицы 18 и 19).

¬ последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшаетс€ ввиду его разведений в лунках. Ёто должно про€витьс€ положительной реакций (–Ќ√ј). ѕри отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по –Ќ√ј.

¬ последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшаетс€ ввиду его разведений в лунках. Ёто должно про€витьс€ положительной реакций (–Ќ√ј). ѕри отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по –Ќ√ј.

 

“аблица є 18.

¬ыбор рабочей дозы антисыворотки дл€ –“Ќ√ј 1

»нгредиенты Ќомера лунок и количество ингредиентов, мл
             
»звестна€ сыворотка 1:100 1,0 - - - - -  
–астворитель   0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
ѕолученные разведени€ 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200  
јЁƒ, 5 % 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
Ёкспозици€ 45 мин при комнатной температуре
–езультат –Ќ√ј ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ - -
“итр –Ќ√ј и рабоча€ доза антисыворотки “итром антисыворотки €вл€етс€ разведение 1:1600, а рабоча€ доза Ц (1:1600):3 = 1:533.

 

“аблица є 19

—хема постановки –“Ќ√ј 1

»нгредиенты Ќомера лунок и количество ингредиентов, в мл
           
–астворитель 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
»сследуемый на антиген материал, 1:10 0,25 - - - -  
ѕолученные разведени€ 1:20 1:40 1:80 1:!60 1:320  
јнтисыворотка в рабочей дозе 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Ёкспозици€ 45 мин при комнатной температуре
јЁƒ, 5 % взвесь 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
Ёкспозици€ 45 мин при комнатной температуре
–езультат –Ќ√ј - - - +++ ++++ ++++

 

–“Ќ√ј-2 (реакци€ торможени€ непр€мой гемагглютинации).

1 этап. √отов€т несколько идентичных р€дов последовательных разведений известной антисыворотки в объеме 0,25 мл в полистироловых панел€х.  оличество р€дов соответствует количеству проб на антиген и еше один - контрольный р€д.

2 этап. ¬о все лунки первого р€да внос€т по 0,25 мл экстракта исследуемого материала на антиген, а во все лунки второго р€да - растворитель по 0,25 мл. ѕанели с лунками осторожно встр€хивают и оставл€ют на 30 мин при комнатной температуре.

3 этап. ѕосле этого во все лунки двух р€дов внос€т по одной капле 5 % взвеси јЁƒ, соответствующего по специфичности антисыворотке. ”чет результатов провод€т через 1,5-2,0 ч (таблица є 20).

¬ случае присутстви€ антигена в материале он нейтрализует антисыворотку и титр –Ќ√ј в первом р€ду будет короче на несколько лунок, чем в контрольном р€ду. ¬ случае отсутстви€ антигена в материале титр –Ќ√ј в первом и во втором р€дах будет идентичным.

Ёти реакци€ (как и вс€ группа реакций метода) позвол€ет вы€вл€ть всю сумму антигена или антител, имеющих специфичность, в отличие от –Ќ√ј, где вы€вл€ютс€ агенты, которые имеют только полноценные свойства.

“аблица є 20.

ѕостановка –“Ќ√ј-2

»нгредиенты 1 р€д лунок Ќомера лунок и количество ингредиентов, мл
                 
1 р€д лунок
јнтисыворотка   - - - - - - -  
–астворитель - 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
–азведени€ 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800  
јнтиген 1:10 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Ёкспозици€ 45 мин при комнатной температуре
јЁƒ, 5 % 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
Ёкспозици€ 45 мин при комнатной температуре
–езультат –Ќ√ј ++++ ++++ ++++ + - - - - -
2 р€д лунок
–астворитель   0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
јнтисыворотка 0,5 - - - - - - -  
–азведени€   1:100   1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800  
Ёкспозици€ 45 мин при комнатной температуре
јЁƒ, 5 % 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
Ёкспозици€ 45 мин при комнатной температуре
–езультат –Ќ√ј ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - -
–езультат анализа ¬ материале есть антиген, на что указывает торможение –Ќ√ј в первом р€ду на 4 лунки по сравнению со вторым р€дом (титр –Ќ√ј 1 р€да 1:400, а второго Ц 1:6400)
                         

 

 

Ёти реакци€ (как и вс€ группа реакций метода) позвол€ет вы€вл€ть всю сумму антигена или антител, имеющих специфичность, в отличие от –Ќ√ј, где вы€вл€ютс€ агенты, которые имеют только полноценные свойства.

ѕри использовании антительного диагностикума возможно вы€вление антигена в –Ќ√ј и антител в сыворотке с помощью –“Ќ√ј. ѕри использовании антигенного диагностикума возможно определ€ть антитела в сыворотке при помощи –Ќ√ј и антигена в материале при помощи –“Ќ√ј. Ёто должно расшир€ть ценность диагностикумов и вы€вл€емость инфекционных больных.

—орбционный метод. —оставл€ют сложные многокомпонентные двухэтапные реакции.

–ќ√ - реакци€ определени€ гаптена.

1 этап. √отов€т последовательные разведени€ (лучше в пробирках) исследуемого материала на антиген в объеме 0,5 мл на растворителе.

2 этап. ¬о все разведени€ внос€т по 0,025 мл 0,5 % взвеси ј“Ёƒ. —месь выдерживают 1,5-2,0 ч и учитывают результат. ѕосле учета реакции отбирают пробирки с отрицательной –Ќ√ј, отмывают антительный диагностикум в этих пробирках путем центрифугировани€ при 3000 об\ мин в течение 5 мин.

3 этап.   осадкам добавл€ют 0,5 мл иммунной сыворотки в рабочей дозе, по специфичности идентичной ј“Ёƒ. –езультат учитывают через 1,5 - 2,0 ч.

¬ случае присутстви€ в материале неполноценного антигена, он будет реагировать с антительным диагностикумом, но не агглютинировать его. ¬несение иммунной сыворотки резко изменит картину: взаимодейству€ с неполноценным антигеном, сорбированном на диагностикуме, антитела добавленной иммунной сыворотки будут агглютинировать этот комплекс и будет получен положительный результат –Ќ√ј. ≈сли неполноценного антигена (неагглютинирующего) в материале нет, то дополнительное введение иммунной сыворотки не приведет к агглютинации антительного диагностикума, т.е. –Ќ√ј будет отрицательной.

ћетод разработан ё.¬.  анатовым (1984 г.) и имеет определенное значение при поиске чумного гаптена (неполноценного антигена) в заброшенных гнездах. ¬ отличие от –Ќ√ј (вы€вл€ет полноценный антиген) и –“Ќ√ј (вы€вл€ет всю сумму антигена: полноценного и неполноценного), –ќ√ определ€ет только неполноценный антиген.  ак видно, реакции не дублируют друг друга, но дополн€ют и расшир€ют диагностическую ценность методов и эритроцитарных диагностикумов.

‘еномен потреблени€ комплемента

‘еномен составл€ют многочисленные реакции, объединенные одним принципом - лизис клеток с участием комплемента.

ѕр€мой метод.

–еакции, основанные на лизисе клеток, достаточно многообразны и мы приводим одну.

–ЅЋ - реакци€ бактериального лизиса.

ћетод не примен€ют.

Ќепр€мой метод.

–Ќ√ем - реакци€ непр€мого гемолиза.

ћетод не примен€ют.

–—  - реакци€ св€зывани€ комплемента.

ƒл€ проведени€ реакции необходимо иметь:

1. ѕробирки, штативы, пипетки, флаконы.

2. –астворитель - 0,85 % раствор хлорида натри€.

3. »сследуема€ сыворотка крови.

4.  омплемент.

5. ¬звесь нативных эритроцитов барана.

6. јнтиген известной специфичности.

Ёто сложна€ многокомпонентна€, четырехэтапна€, двухсистемна€ реакци€.  летками- мишен€ми €вл€ютс€ нативные эритроциты индикаторной (гемолитической) системы.

1 этап. ќпределение рабочего разведени€ гемолитической сыворотки (таблица є 21).

¬ пробирках делают последовательные разведени€ гемолитической сыворотки в объеме 0,5 мл. ¬ эти же пробирки внос€т 3 % взвесь отмытых нативных эритроцитов барана в

“аблица є 21.

—хема определени€ рабочего разведени€ гемолитической сыворотки

  Ќомера пробирок и количество ингредиентов, в мл
»нгредиенты                
√емсыворотка с 1:100 0,5 - - - - - -  
–астворитель 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
ѕолучаемые разведени€ 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800  
3 % взвесь эритроцитов 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
–езультаты –Ќ√ј ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + - -
–абочее разведение гемсыворотки “итром гемсыворотки €вл€етс€ 1:1600, значит рабочим разведением €вл€етс€ (1:1600):3=1:533

 

объеме 0,5 мл. „ерез 60 мин экспозиции учитывают результат –Ќ√ј.

–ассчитывают рабочее разведение сыворотки Ц это разведение гемолитической сыворотки, сконцентрированное в 3 раза от титра –Ќ√ј.

2 этап. “итрование комплемента.

√отов€т р€д пробирок: в первую из них внос€т 0,05 мл комплемента в разведении 1:10, во вторую - 0,1 мл комплемента, в третью - 0,15 мл, в четвертую - 0,2 мл, в п€тую - 0,25 мл, в шестую - 0,3 мл, в седьмую - 0,35 мл, в восьмую - 0,4 мл, в дев€тую- 0,45 мл, в дес€тую - 0,5 мл. ќдиннадцата€ пробирка контрольна€, котора€ содержит 0,5 мл растворител€.(таблица є 22).

¬о все пробирки доливают растворитель до общего объема 0,5 мл, а затем внос€т во все пробирки по 1 мл индикаторной системы и оставл€ют на 30 мин при 37 о —. ѕосле этого, все пробирки просматривают и выбирают наибольшее разведение комплемента, вызывающее гемолиз - это титр комплемента.

“аблица є 22.

—хема титровани€ комплемента (количество пробирок сокращено)

»нгредиенты Ќомера пробирок и количество ингредиентов, мл
               
 омплемент 1:10 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 0,14  
–астворитель 0,45 0,48 0,49 0,4 0,48 0,5 0,42 0,5
–азведени€ 1:100 1:90 1:80 1:70 1:60 1:50 1:40  
√емсистема 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Ёкспозици€ 45 мин при комнатной температуре
–езультат гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз осадок осадок осадок осадок
–абоча€ доза комплемента “итр комплемента составл€ет 1:70, значит рабоча€ доза комплемента: (1:70х30):100= 1:21
                   

¬ реакцию берут разведение комплемента на 30 % выше, чем его титр, это рабоча€ доза комплемента.

3 этап. ѕриготовление индикаторной системы.   3 % взвеси нативных эритроцитов барана добавл€ют равный объем гемолитической сыворотки в рабочем разведении. —месь выдерживают 30 мин при 37о — и осадок эритроцитов трижды отмывают растворителем при осаждении или центрифугировании при 500 об\мин в течение 10 мин. ќсадок эритроцитов ресуспендируют до 3 % взвеси.

ѕостановка –— . “итруют исследуемую сыворотку крови в пробирках от 1:50 до 1:12800 и делают контроли: на сыворотки (исследуемую, положительную и отрицательную), антиген, комплемент. ¬о все разведени€ сыворотки, кроме контрол€ сыворотки, внос€т по 0,5 мл антигена. ¬ контроль сыворотки, комплемента и антигена внос€т по 0,5 мл растворител€. (таблица є 23).

—месь встр€хивают и во все пробирки добавл€ют по 0,05 мл комплемента в рабочей дозе. —месь оставл€ют на 60 мин при 37о

ѕосле экспозиции в каждую пробирку внос€т по 1,0 мл индикаторной системы. —месь встр€хивают и выдерживают 60 мин при 37о —.

. ѕри наличии в сыворотке гомологичных антител, комплемент расходуетс€ на комплекс антиген-антитело первой системы. Ёто про€вл€етс€ отсутствием лизиса индикаторных эритроцитов. ѕри отсутствии антител в сыворотке комплемент не расходуетс€ и тогда взаимодействует со второй системой (индикаторной). ѕри этом эритроциты лизируютс€ в первых пробирках.

–еакци€ св€зывани€ комплемента позвол€ет определ€ть антитела, микробы, вирусы, растворимые антигены, однако он трудоемок и вытеснен при некоторых инфекци€х другими методами.

 

“аблица є 23.

—хема постановки –— 

ƒополнительные сведени€ »нгредиенты Ќомера пробирок и количество ингредиентов, в мл  
               
–азведени€ исследуемой сыворотки    онтроли  
сыворот- ка (+) сыворот- ка (_ ) компле- мент исслед. сывор. антиген  
–астворитель 0,5 0,5 0,5     0,5 0,5 0,5  
»сслед. сыворотка 1:50 0,5 - -       0,5    
–азведени€ 1:100 1:200 1:400       1:100    
јнтиген 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5  
 омплемент 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5  
«аведомо отриц. сыв.         0,5        
«аведомо полож. сыв.       0,5          
Ёкспозици€ 60 мин при 37о с  
√емсистема 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0  
Ёкспозици€ 60 мин при 37о  
–езультат –—  осадок осадок осадок осадок гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз  
–езультат анализа »сследуема€ сыворотка содержит антитела, на что указывает осадок в первых пробирках с сывороткой и положительным контролем, при отрицательной реакции (гемолиз) в других контрол€х  
                               

 

‘еномен иммунофлюоресценции

ќбъедин€ет большую группу методов и реакций, основанных на использовании свечени€ в люминисцентном микроскопе антител, меченых флюорохромом.

Ќепр€мой метод.

–»‘ѕ - реакци€ иммобилизаци€ пр€ма€.

ƒл€ проведени€ реакции необходимо иметь:

1. ѕредметные стекла.

2. »ммунные сыворотки, меченые флюорохромом.

3. јнтиглобулиновые сыворотки, меченые флюорохромом.

4. »сследуемый материал (микробы, культуры и пр.).

5. –астворитель - 0,85 % раствор хлорида натри€.

Ќа обезжиренное предметное стекло делают мазки исследуемого материала или мазки-отпечатки. ѕрепараты подсушивают, фиксируют смесью Ќикифорова. Ќа мазок нанос€т иммунную сыворотку, специфичную в отношении предполагаемого в материале микроба, меченую флюорохромом. ѕрепарат став€т во влажную камеру на 30 мин при 37о —, а затем промывают в растворителе и ополаскивают в дистиллированной воде 10 мин, сушат при 18-20ќ — и исследуют в люминисцентном микроскопе с иммерсионной системой.

≈сли микробы в мазке есть, то вокруг них будут скоплени€ зеленого специфического свечени€, а фон может равномерно слабо светитьс€. Ёто меченые антитела окружили гомологичную клетку. ќценку интенсивности специфического свечени€ ведут по 4-кресной системе: ++++ или +++ €рка€ флюоресценци€, ++ и + слаба€ флюоресценци€ клеток.

Ќепр€мой метод.

–»‘Ќ - реакци€ иммунофлюоресценции непр€ма€.

Ќа обезжиренное предметное стекло нанос€т мазки из исследуемого материала или делают отпечатки из культур клеток или органов. ѕрепарат подсушивают, фиксируют и нанос€т на мазок иммунную сыворотку, гомологичную по специфичности определ€емому микробу. ѕрепарат помещают во влажную камеру на 30 мин при 37о —, затем хорошо промывают растворителем дл€ удалени€ свободных компонентов сыворотки, ополаскивают в воде дистиллированной 10 мин, сушат при комнатной температуре и внос€т меченую сыворотку против иммуноглобулинов иммунной сыворотки.

Ёта видова€ антисыворотка предварительно метитс€ флюорохромом или используют коммерческую меченую антисыворотку.

ѕрепарат помещают во влажную камеру на 30 мин при 37о —, затем хорошо отмывают растворителем и прополаскивают дистиллированной водой, сушат и просматривают в люминисцентном микроскопе.

≈сли в исследуемом препарате содержитс€ микроб, то с ним взаимодействуют антитела иммунной сыворотки и остаютс€ фиксированными на мазке. ћечена€ антисыворотка будет взаимодействовать с Fc-фрагментами антител иммунной сыворотки и ее антитела также будут фиксированы на мазке. Ёто про€витс€ специфическим свечением вокруг микробов. ≈сли микробов нет, то антитела не фиксируютс€, характерного свечени€ не будет (результат отрицательный). ѕри этом необходимы контроли: незараженный материал, гетерогенна€ культура, гомологичные микробы (положительный контроль). — помощью этого метода можно определ€ть антитела в сыворотке при известном микробе в мазке.

“орможение метода.

–»‘“ - реакци€ иммунофлюоресценции торможение.

Ќа обезжиренное предметное стекло нанос€т два мазка-отпечатка или делают мазки из исследуемого материала. »х подсушивают, фиксируют и добавл€ют к опытному мазку одновременно иммунную сыворотку, специфичную к предполагаемому микробу, и вторую Ц эту же иммунную сыворотку, только меченую флюорохромом. ¬ контрольный мазок внос€т иммунную сыворотку, меченую флюорохромом. ѕрепарат выдерживают 30 мин во влажной камере при 37о —, отмывают и прополаскивают дистиллированной водой, просушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом с иммерсионной системой.

≈сли в материале был микроб, то произойдет конкуренци€ меченых и немеченых антител за св€зывание с ним. –езультатом их конкуренции будет снижение интенсивности специфического свечени€ в опытном мазке по сравнению с контролем, где одна мечена€ сыворотка. ≈сли антигена нет, то свечение будет отсутствовать в обоих мазках.

‘еномен преципитации

Ёто взаимодействие растворимых антигенов и антител с образованием агрегатов, что про€вл€етс€ помутнением среды (образованием преципитата).

ќсадочный метод.

Ёто реакции преципитации в растворе электролита, с медленно осаждающимс€ осадком (преципитатом).

– ѕј - реакци€ кольцепреципитации јсколи.

»ммунную сыворотку в небольших разведени€х (1:2-1:10) наливают в коническую пробирку в количестве 3-5 мл. ѕо стенке этой пробирки пастеровской пипеткой осторожно наслаивают на сыворотку равный объем растворимого антигена (экстракт микробов). ƒл€ разведени€ ингредиентов примен€ют 0,85 % раствор хлорида натри€.

ѕри наличии в материале антигена на месте встречи двух компонентов через несколько минут по€вл€етс€ помутнение - беловатое кольцо преципитата. ≈сли антигена нет, то не будет и преципитата.

Ёту реакцию широко примен€ют при определении сибире€звенных бактерий на кожевенно-меховых издели€х.  усочки кожи с мехом выстригают, измельчают, заливают растворителем 1:10 и кип€т€т 30 мин. Ёкстракт используют в – ѕј дл€ определени€ термоустойчивого сибире€звенного антигена.

ƒиффузионный метод.

Ёта группа реакций преципитации ставитс€ в агаровом геле, результат взаимодействи€ растворимых антигена и антител про€вл€етс€ в виде беловатой полоски на границе их встречи в геле - преципитат.

–ѕ√ - реакци€ преципитаци€ в геле.

–еакцию став€т на чашках ѕетри, залитых пептонным агаровым слоем. ѕосередине помещают полоску фильтровальной бумаги, предварительно смоченной антитоксической сывороткой. ѕосле подсушивани€, на рассто€нии 1 см от кра€ полоски делают посевы культур дифтерийного микроба бл€шками до 1 см, с двух сторон полоски бумаги. —реди культур должен быть заведомо токсигенный штамм (положительный контроль) и штамм нетоксигенный (контроль отрицательный). ѕосевы помещают в термостат на 24 ч.

≈сли культуры были токсигенные, то между полоской бумаги и бл€шкой культуры возникает бела€ лини€ преципитации, котора€ совпадает с линией преципитации положительного штамма. ≈сли культуры не токсигенные, то линии преципитации не будет. ѕреципитат образуетс€ благодар€ диффузии антител и антигена в разные стороны в агаре. ¬ месте их встречи по€витс€ бела€ полоска преципитации.

–ѕќ - реакци€ преципитации по ќухтерлоне.

≈ще одна разновидность преципитации в геле. ¬ агаре на чашке ѕетри определенными пробойниками вырезают 4 небольшие лунки, расположенных в виде квадрата, на рассто€нии 0,5 см. ¬ первую лунку внос€т иммунную сыворотку. ¬о вторую лунку р€дом - известный антиген (контроль положительный), гомологичный иммунной сыворотке, котора€ в 1 лунке. ¬ третью лунку, напротив первой лунки, внос€т нормальную сыворотку (отрицательный контроль). ¬ 4 лунку, р€дом с первой, но с другой стороны от нее по сравнению со второй лункой, внос€т испытуемый на антиген экстракт. „ашка ставитс€ во влажную камеру на сутки при 37о — - при необходимости и более суток.

≈сли в испытуемом экстракте присутствует антиген, то полоски преципитации в геле распредел€тс€ между 1 и 2 лунками (контроль), 1 и 4 лунками (опыт) под углом к третьей лунке (отрицательный контроль). ≈сли антигена нет, то будет всего одна полоска между 1 и 2 лунками (положительный контроль).

–»Ё‘ - реакци€ иммуноэлектрофореза.

ѕредставл€ет собой сочетание электрофоретического разделени€ компонентов с иммунопреципитацией.

Ќа стекл€нную пластину нанос€т слой агара толщиной в несколько мм. ¬ застывшем агаре проделывают небольшую лунку и внос€т в нее исследуемый экстракт на антиген. ¬ключают слабый ток и антиген начинает ускоренно двигатьс€ в сторону анода, что и €вл€етс€ электрофорезом. ƒвижение антигена продолжаетс€ несколько часов. «атем поперек движени€ антигена прорезают узкую канавку и заполн€ют ее антисывороткой к антигену, предполагаемому в материале. јнтитела сыворотки диффундируют во все стороны, в том числе - навстречу антигену.

≈сли в экстракте есть антиген, то наблюдаютс€ белого цвета дуги преципитации, где произошло взаимодействие антиген-антитело. ѕластину можно отмыть, окрасить на белки и сравнить со стандартом. “аким образом, если использовать известный антиген, можно определ€ть антитела, а при известной антиглобулиновой сыворотке определ€ть классы »√.

–¬»Ё‘ - реакци€ встречного иммуноэлектрофореза.

»спользуетс€ принцип движени€ компонентов реакции в электрическом поле. Ќа стекл€нной пластине, залитой агаром, делают лунки на рассто€нии 1 см. ¬ одну из них внос€т экстракт на антиген, в другую - антисыворотку. ѕодключают слабый электрический ток. јнтиген движетс€ к аноду, а антитела - к катоду, т.е. навстречу друг другу. ѕри этом методе происходит быстрое их сближение и реагирование (за 60 мин).

≈сли в экстракте есть антиген, то при встрече с антителами будет их взаимодействие, что про€витс€ линией преципитации белого цвета. ѕластину можно отмыть и покрасить дл€ более четкого просмотра линий. ≈сли антигена нет, линий преципитации не обнаруживаетс€. ¬ реакции нельз€ использовать антигены, имеющие кислую реакцию.

‘еномен нейтрализации

ќснован на взаимодействии антител с микробами или его факторами метаболизма.

ћетод иммобилизации.

√руппа реакций основана на обездвиживании подвижных микробов.

–»“ - реакци€ иммобилизации трепонем.

¬ одну пробирку внос€т 0,5 мл антисыворотки, предварительно прогретой при 56о — в течение 15 мин, а во вторую пробирку- 0,85 % раствор хлорида натри€. ¬ обе пробирки добавл€ют по 0,5 мл тканевой культуры хорошо подвижных трепонем. ѕробирки слегка встр€хивают и выдерживают 60 мин при 35о —. «атем пастеровской пипеткой нанос€т на предметное стекло каплю из первой пробирки и из второй, раздельно. Ќакладывают покровные стекла и просматривают под микроскопом в темном поле. ¬ первой пробирке будут наблюдатьс€ обездвиженные трепонемы. ѕроцент иммобилизации трепонем можно подсчитывать по формуле: (ј-¬): ј, где ј - количество подвижных трепонем в контроле, ¬ - в опыте.

–»¬ - реакци€ иммобилизации вибриона.

¬ две пробирки внос€т по 0,5 мл бульонной культуры хорошо подвижных холерных вибрионов дл€ определени€ их специфичности. ¬ одну пробирку внос€т 0,5 мл холерной антисыворотки, например, типа ќгава в разведении 1: 5, во вторую 0,85% раствор хлорида натри€. ѕастеровскими пипетками нанос€т на предметное стекло две капли: из опытной и контрольной пробирок, покрывают покровными стеклами и просматривают в темнопольном микроскопе.

≈сли вибрион по специфичности соответствует сыворотке, то активность его движени€ заметно падает и через несколько минут прекращаетс€. ¬ это врем€ в контрольной капле движение вибриона продолжаетс€. ≈сли антисыворотка была гетерологичной, то на движении вибрионов это не отразитс€.

ћетод нейтрализации

ќснован на нейтрализации вируса антисывороткой, что измен€ет свойства вириона, например, по отношению к эритроцитам.

–“√ј - реакци€ торможени€ гемагглютинации.

–еакци€ может быть направлена на определение антител к вирусу в сыворотках или на обнаружение вируса в материале.

ƒл€ реакции необходимо:

1. Ёритроциты кур.

2. √емагглютинирующий вирус.

3. јнтисыворотка к вирусу.

4. –аствор јльсевера - растворитель.

5. «абуференный раствор 0,85 % хлорида натри€

6. ѕипетки, пластины типа “акачи, пробирки.

 

1. ќпределение антител в сыворотке.

¬ стерильный флакон (250 мл) внос€т 50 мл раствора јльсевера. ¬ стерильный шприц на 50 мл с иглой 7-9 см насасывают 15 мл раствора јльсевера из флакона и делают пункцию сердца взрослой курицы, набира€ 15 мл крови в шприц. »глу снимают, шприц покачивают, перемешива€ жидкость. «атем кровь выливают во флакон. Ёритроциты отмывают в растворе јльсевера и делают в этом же растворе 4 % взвесь.

√еммагглютинирующий вирус готов€т из вирусной суспензии, получа€ взвесь цельного гемагглютинирующего вируса (√¬).

ѕервым подготовительным этапом €вл€етс€ определение титра √¬, путем титровани€ вируса. ¬ микротитраторах типа “акачи в двух паралллельных р€дах делают разведени€ вируса от 1:5 до 1:2560. ƒл€ этого, капельницей внос€т растворитель рЌ 7,2 по 0,05 мл (две капли) во все лунки, начина€ со второй. ¬ первую лунку внос€т гемагглютинирующий вирус (√¬) в разведении 1: 5 в объеме 0,1 мл. — помощью микротитровальных петель объемом на 0,05 мл или дозатора делают разведени€, как обычно. «атем в каждую лунку внос€т по капле 0,5 % взвеси эритроцитов курицы. ѕластины легко встр€хивают и оставл€ют на 30 мин дл€ оседани€ эритроцитов.

«а титр √¬ принимают последнее его разведение, где отмечена полна€ гемагглютинаци€. ƒл€ –“√ј используют 4 гемагглютинирующих единицы. ƒл€ этого разведение √¬, дающее титр реакции, следует сконцентрировать в 8 раз (разделить на 8). ѕосле этого необходимо сделать контроль правильности выбора 4 полученных единиц. ƒл€ этого делают несколько последовательных разведений, начина€ с 4 √≈ (в первой лунке), далее 2 √≈ (втора€ лунка), 1 √≈ в третьей лунке и 0,5 √≈ в четвертой лунке. ¬о все лунки внос€т эритроциты. ≈сли √≈ выбраны правильно, то реакци€ вирусной гемагглютинации будет наблюдатьс€ в первых трех лунках.

ѕостановка опыта. ћикрокапельницей внос€т со 2 по 10 лунку микропланшета по 0,025 мл растворител€ (опытный р€д) и со 2 по 5 лунку второго р€да контрольного. «атем в первые лунки двух р€дов добавл€ют по 0,05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:5.

— помощью петель с головками на 0,025 мл или дозаторов титруют сыворотку как обычно. «атем во все лунки первого р€да внос€т по 1 капле суспензии √¬, содержащей 4 √≈, а в контрольный р€д - по 0,025 мл растворител€.

ѕластины оставл€ют на 30 мин при комнатной температуре. ѕосле этого, во все лунки двух р€дов закапывают по 1 капле 0,5 % взвеси эритроцитов курицы и пластины вновь оставл€ют на 60 мин. Ќачинают учет с контрольного р€да, где эритроциты оседают в виде маленького колечка или пуговочки. ≈сли в сыворотке присутствуют антитела, гомологичные √¬, то в первых лунках первого р€да будет нейтрализаци€ вируса антителами.

Ёто должно про€витьс€ отсутствием гемагглютинации в первых лунках. ¬ последующих лунках первого р€да сыворотка тер€ет концентрацию (учитыва€ последовательные ее разведени€) и не может нейтрализовать весь вирус, поэтому в этих лунках будет наблюдатьс€ положительна€ реакци€ гемагглютинации - в виде зонтика. ≈сли антител не было, то во всех лунках будет гемагглютинаци€.

2. ќбнаружение вируса.

¬ируссодержащий материал внос€т в 1-е лунки двух р€дов микропланшета по 0,025 мл. ¬о все остальные лунки этих р€дов, включа€ и первые лунки, добавл€ют по 0,025 мл 0,85 % раствора хлорида натри€. ƒелают раститровку вируса, как описано выше. ƒалее во все лунки первого р€да внос€т по 0,025 мл известной иммунной сыворотки против предполагаемого вируса, в разведении 1:20. ¬о второй р€д (контроль) внос€т по 0,025 мл растворител€. —месь оставл€ют на 30 мин при 37о —, затем во все лунки двух р€дов добавл€ют по 0,025 мл 1 % взвеси эритроцитов курицы. ”чет реакции ведут через 60 мин экспозиции при 37о —.

¬ контрольном р€ду вирусна€ гемагглютинаци€ будет наблюдатьс€, например, до 8-ой лунки. ¬ опыте могут быть два варианта. ≈сли гемагглютинирующий вирус не соответствует по специфичности сыворотке, то в этом случае титр гемагглютинации в первом р€ду лунок будет соответствовать второму р€ду. ≈сли вирус гомологичен известной иммунной сыворотке, то произойдет из взаимодействие, следовательно, взаимна€ нейтрализаци€, ѕоскольку √¬ в этих лунках не будет, это про€витс€ укорочением числа лунок с реакцией гемагглютинации в первом р€ду, по сравнению с лунками второго р€да. Ќапример, в 1 р€ду гемагглютинаци€ составит 5 лунок.

–еакци€ примен€етс€ в вирусологических исследовани€х дл€ поиска антител или вируса в соответствующем материале.

ћетод гашени€ действи€.

ћетод основан на нейтрализации вируса и его болезнетворного действи€.

–Ќ - реакци€ нейтрализации.

ƒл€ проведени€ метода требуютс€

1. ¬ирус с выраженной инфекционной активностью.

2. јнтисыворотка известна€ или исследуема€.

3. Ѕиологический объект (лабораторное животное, культуры тканей, эмбрионы).

4. –астворители (физиологический раствор при работе с животными, среда 199, »гла, Ёрла - дл€ работы с культурой клеток).

 

¬ируссодержащий материал (¬—ћ) предварительно титруют, определ€€ конечное разведение, которое может вызвать повреждение тканей или инфицирование животных или эмбрионов.

√отов€т 10-кратные разведени€ ¬—ћ в пробирках, использу€ дл€ каждого разведени€ отдельную пипетку. ƒл€ этого, в пробирки внос€т 1 мл растворител€ и в первую пробирку 0,1 мл ¬—ћ. »з первой пробирки перенос€т во вторую 0,1 мл вируссодержащей жидкости, перемешивают, перенос€т 0,1 мл в третью и т.д.  аждое разведение вируса из пробирки внос€т в несколько лунок, содержащих пласт клеток, по 0,2 мл. Ќаблюдают за культурой клеток 2-3 суток. “итр вируса выражают в 50 % дозе - “ »ƒ50, это гибель 50 % клеток.

ѕостановка опыта. ¬ пробирках делают последовательные разведени€ испытуемых сывороток в объеме 0,5 мл. ¬о все лунки внос€т по 100 “ »ƒ ¬—ћ, выдерживают смесь 1-2 ч при комнатной температуре, затем каждое разведение внос€т в пласт клеток в лунках. ≈сли вирус был нейтрализован антителами, то размножени€ в культуре не последует - это про€витс€ отсутствием ÷ѕƒ (цитопатического действи€). “ам, где вирус оставалс€ нативным, отмечено ÷ѕƒ.

¬ариант с животными. Ќапример, провод€т вы€вление антител в сыворотках людей с подозрением на бешенство.   10-кратным разведени€м ¬—ћ в пробирках добавл€ют равный объем исследуемой сыворотки в разведении 1:10. ѕараллельно делают контрольный р€д (нормальна€ сыворотка). ѕробирки оставл€ют на 1 ч при 37о —. —месь ввод€т в мозг молодым взрослым белым мышам и наблюдают 30 суток. ћыши, зараженные смесью вируса с антителами, не болевают, а зараженные смесью вируса с нормальной сывороткой погибают от энцефалита.

÷ветна€ проба. јнтисыворотки смешивают с вирусом по 0,4 мл (“ »ƒ50). „ерез 2 ч внос€т 0,2 мл смеси в лунку с культурой клеток и наслаивают сверху вазелин 0,2 мл дл€ изол€ции от кислорода воздуха. Ќа прот€жении 6-8 дней регистрируют изменение цвета среды. ¬ лунках, где был внесен нейтрализованный вирус, цвет среды изменитс€ от красного к желтому. “ам, где вирус был живым, клетки погибли, а цвет среды оставалс€ красным.

‘еномен иммуноконъюгации

ќснован на конъюгации метки разной природы на одном из компонентов реакции антиген-антитело или на дополнительном агенте.

–»ј - радиоиммунологический анализ.

ѕр€мой метод.

¬ лунки двух р€дов полистироловых планшет внос€т исследуемый на антиген экстракт, в концентрации 0,05 мкг, выдерживают 12 ч при комнатной температуре, отмывают планшет физиологическим раствором, содержащим 5 % по объему фосфатного буфера и 2 % твина-20. ¬ качестве конъюгата используют иммунный глобулин, который соответствует по специфичности предполагаемому антигену, меченный J 125.

¬нос€т конъюгат во все лунки двух р€дов. ¬ыдерживают 60 мин при 37о —, трижды отмывают растворителем и определ€ют дозаторами остаточную долю св€завшейс€ метки, против той, котора€ была на конъюгате.

Ќепр€мой метод.

ѕолистироловые планшеты, примен€емые дл€ »‘ј, нагружают антигеном в рабочей дозе (предварительно выбираетс€ доза, св€зывающа€ 50 % метки). ƒл€ этого, растворимый антиген (вируссодержащую жидкость) заливают в лунки микротитратора пипетками по 0,1 мл и оставл€ют на ночь при комнатной температуре. Ќа другой день лунки с антигеном трижды отмывают растворителем дл€ удалени€ свободного антигена.

¬ лунки с сорбированным антигеном внос€т по 0,1 мл разведени€ испытуемой на антитела сыворотки. –азведени€ сыворотки предварительно готов€т в пробирках и по 0,1 мл внос€т в лунки планшета, начина€ с последней пробирки (внос€т в последнюю лунку) и т.д. ѕланшету оставл€ют на 40 мин при 37о —, трижды отмывают растворителем дл€ удалени€ свободных компонентов сыворотки.

ѕредварительно готов€т конъюгат. »з антисыворотки кроличьей против сывороточных белков человека получают глобулин, путем высаливани€ 40 % сульфатом аммони€. ќт соли глобулин очищают одним из методов, например, пропуска€ через сефадекс G50. «атем этот глобулин добавл€ют к смеси J 125 и хлорамина “ в равных объемах, через 2 мин реакцию останавливают с помощью NaHSO3 и провод€т разделение меченого глобулина и свободных компонентов на сефадексе-G25. ћеченый глобулин консервируют 0,2 % азида натри€.

«аранее приготовленный конъюгат внос€т во все лунки планшет по 0,1 мл, выдерживают в течение 40 мин при 37о —, а затем трижды отмывают лунки растворителем. ƒалее в лунках плпншет следует проводить определение доли св€занного йода по сравнению с количеством его в конъюгате.

“орможение метода.

¬ лунки полистироловых планшет внос€т антиген в рабочей дозе, выдерживают 12 ч при комнатной температуре, отмывают трижды растворителем.

¬ лунки с антигеном внос€т по 0,1 мл исследуемой сыворотки, разведени€ которой предварительно приготовлены в пробирках (как описано выше). ѕланшеты выдерживают 40 мин при 37о —, отмывают растворителем. «атем во все лунки добавл€ют по 0,1 мл иммунного глобулина, меченого J 125, специфичного к сорбированному антигену. ѕланшет выдерживают 40 мин при 37о —, отмывают трижды растворителем. ќпредел€ют остаточную дозу метки в лунках, по сравнению с конъюгатом.

≈сли в исследуемой сыворотке были антитела, то они блокировали антиген в лунках и последующее внесение меченого иммунного глобулина не приводит к св€зыванию его с антигеном. Ёто про€вл€етс€ отсутствием метки в лунках, где были антитела исследуемой сыворотки. ≈сли антител нет, то внесение меченых антител приведет к св€зыванию их антигеном, что про€витс€ по€влением метки во всех лунках. Ёто отрицательный результат.

»фј - иммуноферментный анализ

ќснован на конъюгации метки в виде фермента.

ѕр€мой метод.

ћетод заключаетс€ в непосредственном взаимодействии антигена и антител, когда один из них сорбирован на твердой фазе, а другой мечен ферментом.

¬ насто€щем разделе будет дан новый вариант »‘ј, тогда как известные варианты широко описаны в литературе.

»‘јѕ - иммуноферментный анализ пр€мой.

¬ лунки полистироловых планшет, например, —анкт-ѕетербургского зав. биополимеров или другого производства, внос€т растворимый на антиген материал по 0,1 мл в дозе 0,05 мкг на 1 мл и планшет оставл€ют на 24 ч при комнатной температуре. ѕланшет отмывают растворителем (0,85 % раствор хлорида натри€, содержащий 0,2 % твина-20, рЌ 7,2) от несв€завшегос€ материала.

ѕредварительно готов€т конъюгат: к раствору глобулина иммунной сыворотки, котора€ должна быть гомологичной предполагаемому антигену по специфичности, в дозе 5 мг на мл, добавл€ют равный объем раствора каталазы в дозе 10 мг на мл и 0,1 % от объема смеси 2,5 % глутарового альдегида. —месь выдерживают 30 мин при 37о —, осаждают глобулин 40 % раствором сульфата аммони€, раствор€ют малым объемом растворител€ и освобождаютс€ от солей аммони€, пропуска€ глобулин через колонку с сефадексом G-50. √отовый конъюгат хран€т с 0,05 % азида натри€ или лиофилизируют.

¬о все лунки с материалом внос€т конъюгат по 0,1 мл и смесь оставл€ют на 60 мин, после чего трижды промывают растворителем.

ƒл€ про€влени€ взаимодействи€ антигена с антителом необходимо вы€вить в лунках каталазу. ƒл€ этого, внос€т субстрат - перекись водорода (0,015 % по 0,1 мл) и через 15 мин внос€т хромоген, дл€ про€влени€ реакции каталазы с субстратом - 1 % раствор перманганата кали€. –езультат реакции оценивают по по€влению окрашивани€. ≈сли в исследуемом материале есть антиген, то с ним взаимодействуют антитела, которые мечены ферментом. ƒобавленна€ перекись водорода разрушаетс€ каталазой на воду и атомарный кислород и вносимый хромоген про€вл€ет эту реакцию - жидкость остаетс€ красного цвета. ≈сли антигена не было, то антител также не будет как и каталазы. ѕерекись водорода остаетс€ неразрушенной и добавленный перманганат кали€ моментально мен€ет цвет на желтый, сходный с контрольной лункой.

Ќепр€мой метод.

»‘ј - иммуноферментный анализ.

—уществуем много вариантов постановки »‘ј, в том числе - твердофазных, на одном из них мы и остановимс€.

¬ микропланшеты внос€т по 0,1 мл раствора известного растворимого антигена в дозе 0,05 мкг на мл. ѕланшеты оставл€ют на 24 ч при комнатной температуре, трижды отмывают растворителем.

ƒелают несколько последовательных разведений исследуемой иммунной сыворотки в пробирках в объеме 0,5 мл, начина€ с 1:50. ѕоследней пробиркой €вл€етс€ контрольна€ Ц без сыворотки. Ќачина€ с контрол€, внос€т в последнюю лунку планшета 0,1 мл (контроль), в предпоследнюю лунку планшета - 0,1 мл разведени€ из предпоследней пробирки и т.д. —месь оставл€ют на 30 мин при 37о — и затем трижды промывают лунки растворителем. ѕосле этого внос€т во все лунки видовой конъюгат по 0,1 мл —месь выдерживают 40 мин при комнатной температуре и трижды промывают растворителем. ј затем внос€т субстрат и хромоген.

ѕредварительно делают конъюгат, как описано выше, только в качестве сыворотки берут кроличью антисыворотку к сывороточным белкам человека, которую мет€т ферментом каталазой (как описано выше). ѕолучаем видовой конъюгат против белков сыворотки людей. ѕрименение такого препарата более выгодно, чем на основе гомологичной иммунной сыворотки к антигену. “акую сыворотку необходимо готовить заново при новом антигене, а видовой конъюгат можно использовать во всех случа€х исследовани€ сывороток людей.

≈сли исследуема€ сыворотка содержала антитела, то происходит взаимодействие ее с антигеном и на Fc-фрагмент ее антител прикрепл€ютс€ антитела из конъюгата (кроличь€ антисыворотка к белкам сыворотки человека) меченого ферментом. ќн разлагает внесенный в лунки субстрат и хромоген (перманганат кали€) не изменит своего красного цвета. ≈сли антител в сыворотке исследуемой нет, то не будет и фермента и субстрат будет действовать на хромоген, который мгновенно изменит цвет среды на желтый (таблица є 24).

“аблица є 24.

—хема постановки непр€мого варианта »‘ј

Ћунки планшет ѕоследовательность процесса постановки непр€мого варианта »‘ј
антиген процесс отмывани€ антисы- воротка процесс отмывани€ конъю- гат субстрат хромоген резуль- тат »‘ј
ƒополнительна€ характеристика вносимых агентов, в мг или мл
в рабо-чей дозе фосфатн. буфер + твин-20 - 1:100 или раствори-тель то же на 30 мин перекись водорода на 15 мин перманга-нат кали€   окраска, момен- тально
1-€. ќпыт 0,05 мл 3 раза 0,025 мл 3 раза 0,05 мл 0,05 мл 0,05 мл красна€
2-€.  онтроль 0,05 мл 3 раза растворитель по 0,025 мл 3 раза 0,05 мл 0,05 мл 0,05 мл желта€
                       

 

“орможение метода.

  этому методу относ€тс€ конкурентные пробы, названные так по сути происход€щего процесса. “орможение - это конечный эффект реакций.

¬ лунки микропланшета двух р€дов внос€т иммунный глобулин известной сыворотки дл€ адсорбции на стенках лунок пластин (24 ч при комнатной температуре, рЌ 6,0). ѕосле экспозиции лунки трижды отмывают растворителем. «атем в лунки двух р€дов внос€т по 0,1 мл осветленного копроэкстракта, исследуемого пациента.  опроэкстракт был заранее приготовлен в пробирках в 5 последовательных разведени€х (как описано выше). ѕосле экспозиции 30 мин при 37о —, пластины трижды отмывают растворителем. ¬ первый р€д с экстрактом внос€т общим объемом 0,1 мл смесь сывороток: иммунную и эту же иммунную, но меченую каталазой. ¬о второй р€д - только иммунную сыворотку, меченую ферментом. ѕосле экспозиции 30 мин пластину трижды отмывают растворителем.

¬ оба р€да внос€т перекись водорода, а через 15 мин и перманганат кали€. ѕровод€т учет реакции по изменению цвета лунок в сравнении с контрольным р€дом (второй).

≈сли в исследуемом материале есть антиген, то в первом р€ду произойдет конкуренци€ за детерминанты между мечеными и немечеными антителами. –езультатом этого будет укорочение числа лунок с положительным результатом в первом р€ду по сравнению со вторым, где конкуренции не было. ≈сли антигена не было, то положительных лунок не будет ни в первом р€ду, ни во втором, т.е. цвет лунок будет желтым.

»‘ј считаетс€ одним из лучших методов, примен€емых в практике, с высокой чувствительностью и специфичностью.

ѕримен€емые методы »‘ј описаны в разделе дл€ визуального учета, хот€ существует автоматизаци€ в прочтении результатов и постановке »‘ј. ѕри постановке на современной аппаратуре не виден механизм реакции, поэтому упор был сделан на постановку »‘ј при визуальном прочтении результатов.

—ледует учесть, что на сегодн€ разработаны новые методы, которые не относ€тс€ к иммунологическим, т.е. там нет взаимодействи€ антител с антигенами, например, зонды ƒЌ  и др. или комбинированный молекул€рно-генетический и электрофоретический метод - ѕ÷–.

ѕ÷– Ц полимеразна€ цепна€ реакци€

ћетод предложен американским исследователем  арри ћюллисом (1983), удостоенным в 1993 г Ќобелевской премии. Ёта реакци€ носит название репликации ƒЌ .

ќткрытие термостабильной Tag-полимеразы (ƒЌ -полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aguaticus, оптимум которой находитс€ в области 70-72о —, позволило делать процесс репликации ƒЌ  циклическим. ѕри этом происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ƒЌ .

 омплементарное достраивание цепи начинаетс€ только в стартовых блоках Ц коротких двунитевых участках. ѕрисоединение таких блоков к специфическим участкам ƒЌ  направл€ет процесс синтеза новой цепи только в этом участке ƒЌ .

ƒл€ создани€ стартовых блоков в заданных участках ƒЌ  достаточно использовать две олигонуклеотидных затравки (20 нуклеотидных пар), называемых праймерами. ѕраймеры комплементарны последовательност€м ƒЌ  на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ƒЌ  протекает только между ними.

ћетод ѕ÷– представл€ет собой многократное увеличение числа копий, называемых амплификации, специфического участка ƒЌ , катализируемое ферментом Tag-полимеразой.

 аждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в разных температурных режимах.

1 этап: ƒенатураци€ ƒЌ  (расплетение двойной спирали). ѕротекает при 93-95о — в течение 30-40 сек.

2 этап: ѕрисоединение праймеров (отжиг). ѕрисоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательност€м на противоположных цеп€х ƒЌ  на границах специфического участка. ƒл€ каждой пары праймеров существует сво€ температура отжига, значение которой располагаетс€ в



<== предыдуща€ лекци€ | следующа€ лекци€ ==>
»ммунологические феномены | »ћћ”ЌќЅЋќ“»Ќ√. ћетод состоит из трех этапов.
ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-05-07; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 623 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

Ћогика может привести ¬ас от пункта ј к пункту Ѕ, а воображение Ч куда угодно © јльберт Ёйнштейн
==> читать все изречени€...

1988 - | 1948 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.204 с.