Вирусы не способны к бинарному делению. Они как облигатные внутриклеточные паразиты, требуют для культивирования живые клетки. Это могут быть культуры клеток, куриные эмбрионы, мыши-сосунки и пр.
Культуры клеток. Культуры клеток впервые применили в 20-е годы прошлого столетия. Но только в 1949 г было экспериментально показано, что культуры клеток поддерживают рост вируса полиомиэлита.
Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяются на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Наилучшими являются клетки перевиваемые, позволяющие проводить достаточно много пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток готовят из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью к делению и длительному размножению in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки Hela, предварительно выделенные из карциномы шейки матки, Hep-3 - из лимфойдной карциномы и нормальные клетки амниона человека, почек обезьян и др.
К полуперевиваемым культурам относят диплойдные клетки человека, представляющие собой клеточную систему, позволяющую проводить до 40-50 пассажей. Диплойдные клетки не претерпевают злокачественного перерождения, чем и отличаются от злокачественных.
Взвесь дезинтегрированных клеток ткани в растворе Хенкса или 199 вносят в чашку Петри (флакон) и оставляют на сутки при комнатной температуре. За это время к стеклу дна прикрепляется монослой клеток, остальные не связавшиеся клетки следует отмывать этими же растворами. Монослой культуры клеток заражают исследуемым материалом, который содержит вирусы. На размножение в культуре клеток вируса указывает цитопатическое действие его на клетки (ЦПД).
ЦПД следует выявлять с помощью методов микроскопии по изменению морфологии данной культуры клеток. Культивирование миксовирусов приводит к слиянию клеток, с образованием синтиция, реовирусы сморщивают и деструктируют клетки. Аденовирусы - агрегируют клетки. Вирусы кори, паротита и парагриппа индуцируют образование гигантских клеток - многоядерных. Риновирусы вызывают образование отдельных участков округлых клеток с отростками.
Некоторые вирусы (краснуха) не вызывают видимых ЦПД, но их определяют по интерференции другого вируса, который обладает способностью вызывать дегенерацию инфицированных клеток. ЦПД вирусов просматривают в динамике. Энтеровирусы могут вызывать ЦПД на 1-2 сутки, другие вирусы на 4-6 сутки.
Индикацию вирусов в культуре клеток проводят методами: гемагглютинации, ИФА, гемадсорбции, нейтрализации и пр.
Метод гемадсорбции предполагает внесение в культуру клеток, зараженную вирусом, взвесь эритроцитов. После отмывания культуры клеток 85 % раствором хлорида натрия все эритроциты, кроме адсорбированных на поверхности пораженных клеток, отмываются.
Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод негативных бляшек Дюльбеко. Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара. После инкубации на поверхности агара появляются просветленные участки определенной формы (бляшки) на розовом фоне, представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое культуры клеток. Титр вируса выражается числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.
Куриные эмбрионы. Для получения разных препаратов или чистых культур вирусов используют 8-12 дневные куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы в условиях асептики заражают в 3 полости: амниотическую, алантоисную и желточный мешок.
Скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70 % спиртом и обжигают, а затем протирают скорлупу 2 % раствором йода.
Для заражения в алантоисную полость в скорлупе над воздухом проделывают отверстие. Шприцем вводят в него 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 см дальше воздушной подушки. Отверстие в скорлупе заливают парафином.
Заражение в хорион-алантоисную оболочку. Используют эмбрионы 10-12 дневного возраста. Яйцо просвечивают в свете и выбирают бессосудистую область, отмечают локализацию воздушного мешка. Делают искусственный мешок над отмеченным местом, затем снимают скорлупу острым инструментом, освобождают наружную оболочку, которую отслаивают осторожным надавливанием. Делают второе отверстие у края воздушного мешка. Через это отверстие отсасывают воздух и хорион-алантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. Заражение вируссодержащим материалом (0,1-0,2 мл) делают в оболочку хорион-алантоиса.
Заражение в амниотическую полость. Используют 7-14 дневные куриные эмбрионы. После отслоения хорион-алантоисной оболочки, расширяют отверстие с помощью пинцета, захватывая амниотическую оболочку. Ее выводят через хорион-алантоисную оболочку. Инокулят вводят через эту оболочку непосредственно в амниотическую полость.
Заражение в желточный мешок. Используют 3-8 дневные эмбрионы. В этом возрасте желточный мешок занимает почти всю полость яйца.
Скорлупа обрабатывается как описано выше, делают отверстие в воздушном мешке и вируссодержащий материал вводят в мешок желточный, непосредственно.
Наблюдения за эмбрионами начинают вести через 24-48 ч инкубации при 370 С.
Вскрытие куриного эмбриона производят через 48-72 ч инкубации при 370 С. После обработки спиртом и 2 % раствором йода скорлупу рассекают ножницами немного выше границы воздушной камеры, наклоняя яйцо, чтобы скорлупа не попала в полость
Снимают оболочку и рассматривают хорион-алантоисную оболочку, отмечая очаги поражения.
После вскрытия алантоисной оболочки отсасывают алантоисную жидкость, разливают в пробирки или лунки полистироловых планшет по 0,5 мл. Затем добавляют 0,2 мл 1 % взвеси суспензии отмытых куриных эритроцитов, выдерживают при комнатной температуре до 1 ч.
Учитывают результаты реакции: выраженная гемагглютинация - на ++++ креста, тонкая пленка склеившихся эритроцитов +++, наличие просветов в пленке ++, хлопьевидный осадок (-). Наличие гемагглютинации указывает на присутствие вируса в исследуемом материале.
Лабораторные животные. В основу открытия первых вирусов был положен принцип фильтруемости через бактериальные фильтры (1902).
Макс Тейлор положил начало современному этапу работ в вирусологии, основанное на использовании животных - мышей. В 1948 г Долдофор и Сойклаз применили в работе с вирусами мышей-сосунков.
Для лабораторных исследований обычно применяют белых мышей-сосунков.
А также крыс хлопковых, кроликов, хомяков, обезьян и пр.
Сущность метода состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в эмбрионах или культуре клеток.
К недостаткам относят возможность контаминации животных другими инфекциями, а также не последующее заражение культур клеток для выделения чистой культуры.
Подготовка материала. Жидкие материалы, не содержащие в норме бактерий (кровь, спинномозговая жидкость, сыворотка) могут быть использованы для заражения животных в нативном виде.
Ткани промывают в стерильной воде, нарезают на мелкие куски и измельчают. Затем добавляют растворитель до 10-20 % взвеси. Суспензию центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 мин. Для заражения используют надосадок.
Если материал содержит бактерии (носоглоточные смывы, фекалии, насекомые и пр.), то они должны быть удалены: с помощью антибиотиков, фильтрования через фарфоровые свечи, дифференциального ультрацентрифугирования и пр.
Экспериментальное заражение животных
Экспериментальное заражение животных в лабораторной практике имеет большое значение. Перед опытом их взвешивают, измеряют температуру.
Заражение животных интрацеребральное. Применяют для выделения нейротропных вирусов. Мышей заражают группами по 6 штук, перед заражением их наркотизируют и материал в количестве 0,03 мл вводят в мозг, несколько выше орбитального бугра. За ними ведут наблюдение 2-4 недели. Если животные погибают за этот срок, то мозг и кровь из сердца подвергают бактериологическому исследованию для исключения бактериального загрязнения. Выживших животных забивают и исследуют органы на вирусы.
Интраназальное заражение животных. Наркотизируют животных, материал вводят с помощью капиллярной пипетки в носовые ходы каплями. В дальнейшем получают органы погибших или забитых животных и исследуют их вирусологическими и др. методами, включая гистологию срезов органов.
Подкожный способ заражения. Место инъекции дезинфицируют, предварительно удалив волосы. Кожу захватывают в складку, вводят в нее иглу и медленно впрыскивают материал. Затем складку отпускают, накладывают на место укола вату, смоченную в дез.растворе, быстро извлекают иглу. Уколы делают в область бедра (кроликам), мышам и крысам - в поясницу у корня хвоста.
При внутримышечном способе материал вводят кроликам в мышцу бедра.
Внутрикожный способ. В толщу кожи вводят 0,1-0,2 мл материала туберкулиновым шприцем. На месте введения образуется пузырь.
Внутрибрюшинный способ. Животное держат вниз головой, инъекцию тупой иглой делают в нижнюю часть живота, сбоку от средней линии. Сначала вводят иглу под острым углом, проколов кожу, иглу поворачивают под прямым углом. Толчкообразным движением прокалывают брюшную стенку, при этом ощущается провал в полость.
Внутривенное введение. Кроликам вводят материал в ушную вену. Сдавливают корень уха, чтобы набухли вены. Можно потереть кожу ксилолом и вены будут виднее. После прокола вены иглой, сдавливание корня уха прекращают, жидкость медленно вливают в вену.
Вскрытие животных. Животное умерщвляют эфиром или хлороформом.
В противочумной практике их опускают при помощи щипцов в дез.раствор для уничтожения эктопаразитов и обезвреживания кожи, вынимают и кладут на сетку, чтобы стекал дез.раствор, а затем переносят животное на препаровальный столик. Мышей и морских свинок вскрывают на доске.
Ножницами разрезают кожу от лобка до нижней челюсти и делают разрезы к лапкам. Кожу отпрепаровывают и осматривают.
Паховые лимфоузлы, отрезают часть от них и делают мазок-отпечаток на предметное стекло, а остальную часть засевают в бульон. Делают разрез ножницами грудной клетки, захватив пинцетом отросток мечевидный, ребра прорезают с обеих сторон и перерезают ключичные кости. Осматривают лимфоузлы, легкие, сердце. Часть органов захватывают пинцетом и отрезают, разрезанной поверхностью делают мазки-отпечатки и засевают кусочек органа в жидкие питательные среды. Далее приподнимают пинцетом брюшину у нижнего края и разрезают ножницами снизу вверх.
Проводят осмотр органов и лимфоузлов, а затем с помощью пинцета и ножниц отрезают кусочки органов, делают мазки-отпечатки и кусочки засевают в жидкие питательные среды.
Животных после вскрытия, павших либо погибших во время опыта, следует автоклавировать или сжигать в крематории. Зараженные банки, где держали грызунов, следует обработать 10 % хлорной известью. Подстилку и остатки корма сжигают.
