Осаждение белков органическими кислотами

Принцип метода: Органические кислоты также вызывают необратимое осаждение белков. Большое практическое применение получили трихлоруксусная и сульфосалициловая кислоты, обладающие высокой чувствительностью по отношению к белку. Помимо белков, сульфосалициловая кислота осаждает также продукты их распада высокомолекулярные пептоны и полипептиды. Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки. После осаждения белков трихлоруксусная кислота удаляется путем кипячения фильтрата.

Реактивы: раствор яичного белка для высаливания; трихлоруксусная кислота, 10% раствор; сульфосалициловая кислота, 20% раствор.

Ход работы: К 5 каплям раствора белка добавляют 2 капли 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Выпадает осадок белка.

К 5 каплям раствора белка добавляют 2 капли 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

 

Осаждение белков органическими растворителями.

Принцип метода: В органических растворителях, таких как спирт, ацетон, эфир и др., белки не растворяются и выпадают в осадок. В зависимости от природы белка требуются различные концентрации спирта. Спирт связывает воду, вызывая дегидратацию мицелл белка и неустойчивость их в растворе. Реакция осаждения белка спиртов обратима при кратковременном действии спирта на холоде.

Реактивы: раствор белка для высаливания; этиловый спирт или ацетон; хлористый натрий, насыщенный раствор;

Ход работы: К 5 каплям раствора белка приливают 15-20 капель этилового спирта или ацетона. Раствор мутнеет. Добавляют 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия, при стоянии выпадает белый осадок белка.

 

Осаждение белков алкалоидными реактивами.

Принцип метода: Осаждение белков алкалоидными реактивами также относится к необратимым реакциям. К группе реактивов на алкалоиды принадлежит танин, также пикриновая кислота, железистосинеродистая кислота, фосфорномолибденовые кислоты и др. Способность белков осаждаться теми же реактивами, что и алкалоиды, объясняется наличием как в белках, так и в аналогичных азотистых гетероциклических группировок: пиррольных, индольных, имидазольных и др. механизм осаждения белков алкалоидными реактивами связан с образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотсодержащими группами белка. В этом соединении белок является катионом, а алкалоидный реактив – анионом. Реакции осаждения проводят в кислой среде, способствующей появлению положительного заряда на мицелле белка.

Танин — это сложный эфир глюкозы и пяти молекул метадигалловой кислоты (пентадигаллоилглюкоза). При полном гидролизе танина выделяются глюкоза и галловые кислоты.

Реактивы: раствор белка для высаливания; танин, насыщенный раствор; уксусная кислота, 1% раствор.

Ход работы: К 5 каплям раствора белка прибавляют 1-2 капли насыщенного раствора танина и 1-2 капли 1% раствора уксусной кислоты. Выпадает осадок белка желтовато-серого цвета.

 

Вопросы для самоконтроля:

1. Как ведут себя белки в водном растворе и в присутствии избытка кислоты или щелочи?

2. Что такое изоэлектрическая точка белка и как её определяют?

3. От чего зависит растворимость белка? Какие факторы стабилизируют белок в растворе?

4. Каковы общие механизмы осаждения белка из растворов? Какими способами можно осадить белок, не вызывая его денатурацию?

5. Что такое высаливание белков?

6. Что такое денатурация белков? Какие денатурирующие белок агенты вам известны?

7. В чем заключается разница между осаждением и денатурацией белка?

8. Каким образом можно разделить альбумины и глобулины?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5.

СТРОЕНИЕ СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ.

Теоретическая часть.

Сложные белки – комплексы, состоящие из белка и небелкового компонента, называемого простетической группой. К сложным белкам относятся: нуклеопротеиды, хромопротеиды, фосфопротеиды, гликопротеиды, липопротеиды, металлопротеиды и сложные белки-ферменты.

Нуклеопротеиды. Нуклеопротеиды (ядерные белки) – комплекс нуклеиновых кислот с белками (протаминами или гистаминами). Последнин обладают щелочными свойствами за счет большого количества входящих в них диаминомонокарбоновых кислот (аргинин, лизин и гистидин).

Нуклеиновые кислоты – ДНК и РНК – биополимеры с большой относительной молекулярной массой, построенные из большого количества мононуклеотидов, соединенных друг с другом 3-5-фосфодиэфирной связью.

Структурной единицей нуклеиновых кислот является мононуклеотид, состоящей в свою очередь из пуринового или пиримидинового основания, углевода (D-рибозы или D-дезоксирибозы) и фосфорной кислоты.

Пуриновые основания представлены аденином и гуанином (производные пурина), а пиримидиновые – цитозином, урацилом и тимином (производные пиримидина):

 

В состав ДНК входит тимин, а в состав РНК вместо тимина – урацил. Помимо этих оснований обнаружены минорные основания, входящие в состав РНК и ДНК.

Примером мононуклеотида является адениловая кислота. Динуклеотид из адениловой и уридиловой кислот, соединенных 3-5-фосфодиэфирной связью, имеет следующее строение:

В живых организмах обнаружено два типа нуклеиновых кмслот: рибонуклеиновые (РНК) и дезоксирибонуклеиновые (ДНК) кислоты. В состав ДНК входят дезоксирибонуклеозидмонофосфаты, а в состав РНК – рибонуклеозидмонофосфаты.

В живой клетке любого организма содержатся три вида рибонуклеиновых кислот: рибосомная (рРНК, 80%), транспортная (тРНК, 15%) и информационная (иРНК, 5%). Нклеиновые кислоты имеют первичную, вторичную и третичную структуру. Биологическая роль нуклеопротеидов огромна. Она являются структурными компонентами клетки, её ядра и цитоплазмы, а также выполняют определенные специфические функции в живом организме. Деление клеток, передача наследственной информациии, биосинтез белков связаны с нуклеопротеидами, с входящими в их состав нуклеиновыми кислотами.

При непродолжительном гидролизе нуклеопротеиды распадаются на белок и нуклеиновые кислоты, а при продолжительном гидролизе белки и нуклеиновые кислоты распадаются на основные компоненты, что можно представить в виде схемы:

нуклеопротеиды

белок (протамины или гистоны) нуклеиновые кислоты(полинуклеотиды)

полипептиды мононуклеотиды

аминокислоты нуклеозиды фосфорная кислота