Кислотный гидролиз и формоловое титрование по серенсену

 

Теоретическая часть.

Гидролиз — распад сложного вещества на более простые составные части, связанный с присоединением воды по месту разрыва связей.

В зависимости от применяющегося катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов.

Гидролиз, проводимый в лабораторных условиях, является важным методом исследования для расшифровки первичной структуры белков. При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты: триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин — частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот. Гидролизаты белка применяются в качестве лечебных препаратов для парентерального питания.

 

Практическая часть.

Кислотный гидролиз.

При кислотном гидролизе белки распадаются на высокомолекулярные пептиды, низкомолекулярные пептиды, дипептиды и аминокислоты. Полный гидролиз белка протекает при многочасовом кипячении раствора в круглодонной колбе с воздушным холодильником в присутствии хлористоводородной или серной кислоты.

Реактивы: хлористоводородная кислота концентрированная.

Ход работы: Белок от 2-х куриных яиц растворяют в 1 литре воды, фильтруют через 4 слоя марли. Раствор переносят в большую круглодонную колбу с воздушным холодильником и добавляют 250 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь кипятят 45 мин от начала кипения, затем фильтруют.

Формоловое титрование.

Служит для определения количества карбоксильных групп, которое увеличивается вследствие разрыва пептидных связей в процессе гидролиза. В водных растворах аминокислоты образуют внутримолекулярные соли, например глицин:

Поэтому без предварительного блокирования аминогрупп формальдегидом непосредственно титровать карбоксильные — группы аминокислот щелочью невозможно.

Принцип метода. В процессе реакции формальдегид блокирует α-аминогруппу. Образующееся метиленовое соединение (метилен-аминокислота) оттитровывается щелочью с образованием:

 

 

Определяя количество карбоксильных групп титрованием, одновременно можно судить и о содержании аминных групп, так как количество титруемых карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп. Метод формолового титрования позволяет следить за ходом гидролиза белка и изучить действие протеолитических ферментов. При полном гидролизе белка количество аминных и карбоксильных групп в гидролизате перестает увеличиваться и биуретовая реакция становится отрицательной.

Реактивы: раствор яичного белка;гидролизат белка; формалин нейтральный, 20% раствор; фенолфталеин, 0,5% раствор; едкий натр, 0,05 н раствор (готовят из 0,1 н NаОН обязательно ех temporae); едкий натр, 1% и 10%, растворы; уксусная кислота, 1% раствор.

Ход работы:

1. Титрование карбоксильных групп в растворе белка до гидролиза. Отмеривают в колбочку 1мл раствора яичного белка, приливают 5 капель 20% нейтрального раствора формалина и 3 капли 0,5% раствора фенолфталеина. Титруют из микробюретки 0,025н раствором едкого натра до устойчивой бледно-розовой окраски.

2. Титрование карбоксильных групп в гидролизате. Отмеривают в колбочку 1,25мл гидролизата, добавляют 3 капли фенолфталеина и нейтрализуют 10% раствором едкого натра из макробюретки (шприц) до слабо-розовой окраски. Щелочь используется для нейтрализации соляной кислоты, поэтому количество щелочи не учитывается. Если при нейтрализации окраска делается ярко красной, то добавляют до обесцвечивания по каплям 1% раствор уксусной кислоты, избыток которой нейтрализуют 1% раствором едкого натра до слабо-розовой окраски. Затем приливают 5 капель нейтрального 20% раствора формалина и обесцвеченный раствор титруют 0,025н раствором NаОН до бледно-розового цвета и точно отмечают количество затраченной щелочи. Производят расчет азота аминогрупп по количеству затраченной щелочи, исходя из ее нормальности. Нормальному раствору щелочи соответствует 14г азота в одном литре или 14мг в 1мл; 1 мл 0,025н раствора соответствует 0,033 мг азота.

3. Открытие промежуточных продуктов распада белка в гидролизате при помощи биуретовой реакции. В пробирку наливают 5 капель гидролизата белка и нейтрализуют 10% раствором щелочи. После нейтрализации гидролизата проводят биуретовую реакцию, прибавляя 2 капли CuSO₄. Появляется фиолетово-розовое окрашивание. При полном гидролизе белка до аминокислот биуретовая реакция с гидролизатом отрицательная.

 

Вопросы для самоконтроля:

1. Что такое гидролиз белка, какие виды гидролиза вы знаете?

2. Каково практическое значение гидролиза белков?

3. Чем отличаются полный и неполный гидролиз?

4. Для чего служит метод формолового титрования? На чем он основан?

5. О чем говорит розовое окрашивание гидролизата белка?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4