Ксантопротеиновая реакция (Мульдера)

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1

ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ.

Теоретическая часть.

Значение цветных реакции состоит в том, что они дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, растворах и установить аминокислотный состав различных природных белков. Эти реакции применяются как для качественного, так и для количественного определения белка и содержащихся в нём аминокислот.

Существует два типа цветных реакций: 1) универсальные — биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на все α-аминокислоты и белки); 2) специфические — только на определенные аминокислоты как в молекуле белка, так и в растворах отдельных аминокислот (реакция Фоля на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу, реакция Миллона на тирозин, реакция Сакагучи на аргинин и т.д.).

При проведении цветных реакций на белки и аминокислоты необходимо предварительно составить следующую таблицу:

№

Название реакции

Применяемые реактивы

Появление окрашивания

Что открывает данная реакция, её химизм

 

Практическая часть.

Биуретовая реакция

Принцип метода. Биуретовая реакция открывает пептидную связь в белке. В щелочной среде раствор белка при взаимодействии с ионами меди приобретает сине–фиолетовый цвет, а продукты неполного гидролиза его — пептоны — розовое окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Биуретовая реакция схематично протекает так:

Енольная форма полипептида, образованная в сильно щелочной среде, дает отрицательный заряд, и кислород, взаимодействуя с медью, образует ковалентную связь, а, взаимодействуя с атомами азота, медь образует координационные связи. Степень окраски биуретового комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе. Нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий осадок гидрата окиси меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

Отдельные аминокислоты, такие как гистидин, серин, трионин, аспарагин дают положительную биуретовую реакцию при условии больших концентраций их в растворе.

Примечание: биуретовая реакция получила свое название от производного мочевины — биурета. Биурет, имеющий группировку –CO-NH- образуется при нагревании мочевины с отщеплением от неё аммиака и дает то же окрашивание, что и белки.

Строение биуретового комплекса:

Образование биурета:

Как можно видеть из приведенной выше формулы, биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:

 

 

Реактивы: раствор яичного белка (1—2 белка куриных яиц отделяют от желтков, взбалтывают с 1 л воды); едкий натр 10% раствор; сернокислая медь 1% раствор.

Ход работы: к 5 каплям раствора белка прибавляют 3 капли 10% раствора едкого натра и 1 каплю сернокислой меди, перемешивают; содержимое пробирки приобретает фиолетовый цвет.

Нингидриновая реакция.

Принцип метода. Нингидриновая реакция характерна для аминокислот, чья аминогруппа находится в α-положении, а также белков и полипептидов. Аминокислоты, полипептиды, белки при кипячении с водным раствором нингидрина дают синее или сине-фиолетовое окрашивание. В результате взаимодействия α-аминокислоты с нингидрином образуется шиффово основание, которое перегруппировывается, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден. Химизм реакции с водным раствором нингидрина следующий:

 

 

 

Аминодикетогидринден конденсируется ещё с одной молекулой нингидрина. Образовавшееся соединение, енолизируясь, переходит в окрашенную форму, получившую название «сине-фиолетовый комплекс Руэмана», формула которого

 

Реактивы: раствор яичного белка, нингидрин, 0,1 % раствор.

Ход работы: к 5 каплям раствора белка приливают 5 капель раствора нингидрина, кипятят 1-2 минуты. Появляется сине-фиолетовое окрашивание. С течением времени раствор синеет.

Примечание: нингидриновая реакция со спиртовым раствором нингидрина широко используется для разделения аминокислот хроматографическим методом, для открытия отдельных аминокислот и определения их количества. В присутствии органических растворителей образовавшееся шиффово основание не распадается, поскольку в соединении нет воды. Конденсируясь с нингидрином, оно содержит в своем составе радикал исходной аминокислоты, который обусловливает различную окраску: синюю, фиолетовую, а в присутствии пролина — желтую.

 

Ксантопротеиновая реакция (Мульдера).

Принцип метода. Ксантопротеиновая реакция доказывает присутствие в белке ароматических аминокислот: триптофана, фенилаланина, тирозина. При обработке раствора белка концентрированной азотной кислотой появляется желтое окрашивание (нитрование), которое при добавлении щелочи переходит в оранжевое. Химизм реакции нитрования с образованием нитросоединения следующий:

 

Реактивы: раствор яичного белка; раствор тирозина 0,05 %; раствор желатина; азотная кислота концентрированная; аммиак концентрированный.

Ход работы: Берут 3 пробирки. В первую вносят 4 капли раствора тирозина, во вторую — 4 капли раствора желатина, в третью — столько же раствора яичного белка. В каждую пробирку добавляют по 2 капли азотной кислоты. Нагревают пробирки и отмечают появление желтого окрашивания. После охлаждения добавляют в каждую пробирку по 5-7 капель водного раствора аммиака, при этом желтая окраска сменяется на оранжевую.

Примечание: реакция носит название ксантопротеиновой от греческого xanthos — желтый. Реакция обеспечивает появление желтого окрашивания при попадании конц. азотной кислоты на кожу, ногти и т.д. Такую реакцию дают более простые ароматические соединения, например, фенолы. Желатин, сальмин, клупеин (протамины) дают отрицательную реакцию, так как в них отсутствуют ароматические аминокислоты.

 

Реакция Фоля.

Принцип метода. Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистеина и цистина, содержащих слабосвязанную серу. Метионин, хотя и является содержащей серу аминокислотой, данной реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно. Реакция состоит в том, что при кипячении белка со щелочью аминокислоты цистеин и цистин легко отщепляют серу в виде сульфида металла, который с плюмбитом дает черный или бурый осадок сернистого свинца.

Реактив Фоля состоит из 5 % раствора уксуснокислого свинца и избытка 10 % раствора едкого натрия. Реакция протекает в реактиве Фоля по следующим уравнениям:

 

 

Реактивы: раствор яичного белка; реактив Фоля (к 5-10 % раствору уксуснокислого свинца добавляют раствор едкого натра до растворения).

Ход работы: к 5 каплям раствора белка добавляют 5 капель реактива Фоля. Интенсивно прокипятить и дать постоять 1-2 минуты. При этом появляется черный или бурый осадок сульфида свинца.