Радиальная (распределительная) жидкостная хроматография

Принцип метода. Отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органический растворитель, например, фенол, бутанол с уксусной кислотой. Из двух частично смешивающихся жидкостей один растворитель должен быть полярным - неподвижная фаза, а другой неполярным — подвижная фаза. Более гидрофобная аминокислота или другое вещество, лучше растворяющееся в неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого смесь аминокислот по окончании хроматографического разделения оказывается на разном расстоянии от линии старта.

Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри. Растворитель перемещается от центра к периферии и захватывает аминокислоты, которые распределяются концентрическими кругами и обнаруживаются после высушивания бумаги и проведения нингидриновой реакции.

Реактивы: 0,5% раствор смеси аминокислот: аланин, аргинина и лейцина. Можно использовать смесь других аминокислот, Rf которых при работе с соответствующими растворителями резко отличаются друг от друга. Растворитель: смешивают 40 мл бутилового спирта, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл дистиллированной воды. После расслоения используют верхний слой уксусной кислоты с бутанолом, насыщенный водой. 0,1% раствор нингидрина на водонасыщенном бутиловом спирте.

Ход работы: На диске фильтровальной бумаги с помощью 2-х параллельных разрезов выделяют бумажный «хвостик». Разрезы должны проходить от края до середины диска и располагаться друг от друга на расстоянии 1см. Затем бумажный «хвостик» укорачивают на 1,5 — 2см и отгибают по месту соединения с бумагой перпендикулярно плоскости диска. Для получения при хроматографии вполне круглых зон необходимо, чтобы длина разрезов была одинаковой (рис.1). Раствор смеси аминокислот (0,002 мл) наносят на место сгиба и высушивают на воздухе. Затем бумажный диск помещают между двумя половинками чашки Петри, нижняя из которых наполовину заполнена растворителем.

Скорость хроматографирования зависит от ширины «хвостика» и от расстояния между поверхностью жидкости и поверхностью бумаги, а также от качества фильтровальной бумаги.

Через 1 час, когда растворитель на диске фильтровальной бумаги будет иметь диаметр 6-7 см, бумагу высушивают на воздухе или в сушильном шкафу при температуре 70 — 80⁰С для удаления растворителя. Высушенную хроматограмму быстро, одним движением, смачивают раствором нингидрина, налитым в чашку Петри, и вновь высушивают в сушильном шкафу при температуре 90-100⁰С в течение 5 минут. При этом проявляются аминокислоты в виде трех колец, окрашенных в фиолетово-красный цвет, которые указывают на разделение аланина, аргинина и лейцина.

Рис 1 Заготовка для хроматограммы Рис. 2 Хроматограмма.

 

Для каждой аминокислоты рассчитывают коэффициент Rf или скорость перемещения по формуле: а/b, где а — расстояние в миллиметрах, пройденное аминокислотой от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна; b — расстояние в миллиметрах от места нанесения аминокислоты (линии старта) до фронта растворителя (рис. 2). Чем меньше растворимость аминокислоты в воде и чем больше ее растворимость в органическом растворителе, тем быстрее она движется вслед за фронтом органического растворителя, тем больше величина Rf, и, наоборот, чем больше ее растворимость в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее аминокислота будет передвигаться и тем меньше величина Rf. Сравнивают коэффициент распределения известных стандартных аминокислот с коэффициентом распределения аминокислот, полученных для исследуемой смеси и определяют наличие отдельных аминокислот в исследуемом материале. Rf для аланина должно быть в пределах от 0,40 до 0,42; для аргинина — 0,12-0,20; для лейцина — 0,60-0,72.

 

Вопросы для самоконтроля:

1. Какие существуют разновидности хроматографического метода разделения веществ?

2. В чем заключается сущность хроматографического метода определения аминокислот на фильтровальной бумаге?

3. Какая фаза растворителя в данной работе является подвижной, а какая – неподвижной?

4. От чего зависит коэффициент распределения аминокислот?

5. Для чего в данной работе проделывают реакцию с нингидрином?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3