Глибинний спосіб культивування мікроорганізмів-продуцентів ферментів

Технологічний процес культивування мікроорганізмів-продуцентів фермен­тів включає такі стадії: приготування посівного матеріалу в лабораторії; приготу­вання чистої культури мікроорганізмів у виробничих умовах; приготування пожив­ного середовища для ферментації; ферментація.

На спиртових заводах використовують ферментні препарати Глюкаваморин Гх-466, який містить як основний фермент глюкоамілазу і АмІлоглюкаваморин Гх-466, що містить -амілазу і глюкоамілазу у співвідношенні приблизно 1:3. Продуцент в обох випадках - - 466, але різний склад поживного середовища.

Для синтезу -амілази використовують продуценти таін.

Поживні середовища. Вибір середовищ для кожного продуцента проводять дослідним шляхом з врахуванням фізіологічних потреб мікроорганізму й умов його культивування. Для глибинного культивування використовують рідке середовище з додаванням джерел азоту, вуглецю, мікроелементів, активаторів росту і стабіліза­торів ферментів.

Джерелом азоту можуть бути фосфат амонію двозаміщений, , ку-

курудзяний екстракт, витяжка із солодових паростків та ін. Кращі результати отри­мують при поєднанні мінерального й органічного азоту, наприклад, при внесенні дріжджового автолізату, кукурудзяного екстракту та інших природних субстратів, які містять значну кількість аспарагінової і глютамінової кислот.

Джерелом вуглецю для продуцентів амілаз найчастіше є крохмаль різного по­ходження. Може використовуватися кукурудзяна, пшенична або інших культур зе­рна мука. У процесі приготування живильного середовища крохмаль частково гІд-ролізують ферментами.

Використання середовищ для культивування глюкоамілазних продуцентів аwamогі з високою концентрацією крохмалю дозволяє синтезувати глюкоамілазу концентрацією більше 250 од. в 1 мл культурального середовища.

Наприклад, поживне середовище для 466 складається із кукуру-

дзяного сусла, оцукреного солодом або мікробними ферментними препаратами за технологічним режимом, близьким до спиртового виробництва і містить 18-20 % сухих речовин.

Розмноження посівної культури. Вид і склад посівного матеріалу залежить від продуцента: для грибів це вегетативна міцеліальна маса або спороносна повер­хнева, для бактерій - молода культура на початковій стадії спороутворення.

Споровий матеріал гриба - 466 готують у лабораторії в пробір-

ках на агаризованому поживному середовищі, що містить {в %): глюкози - 2,0; нітрат натрію - 0,91; хлорид калію - 0,05; сульфат магнію - 0,05; дигідрофосфат -0,10; сульфат заліза - 0,001. Середовище стерилізують при 0,1 МПа протя-

гом 40 хв. Культуру гриба культивують протягом 12 діб в термостаті при 25° С. Цю культуру використовують для приготування рідкого посівного матеріалу.

Посівну культуру готують у декілька стадій, поступово збільшуючи масу куль­тури продуцента.

Для гриба готують рідке середовище такого складу (в %): куку-

рудзяна мука - 5,0; вода - 94,5. рН середовища доводять розчином до 4,8.

Приготоване середовище розливають у качалочні колби по 300 мл в кожну і стери­лізують при 120-125° С упродовж 40-60 хв. Після охолодження до 26° С в середо­вище засівають суспензію конідій з пробірок. Вирощування на качалках проводять при температурі 24-26° С упродовж 36-48 год. Готову культуру передають на дру­гу стадію.

Живильне середовище для другої стадії культивування таке ж, як і для першої. Стерильне середовище розливають в ємкості 6 л по 2,5 л в кожну і засівають посі­вною культурою першої стадії в кількості 10-12 % до об'єму середовища. Культи­вують упродовж 48 год при 24-26° С.

----------------------------------------- Одержання солоду та мікробних ферментних препаратів------------

У третій стадії посівну культуру вирощують у виробничих умовах в інокуля-торах на кукурудзяному суслі концентрацією 6 % СР протягом 48 год при темпера­турі 27° С. Середовище перемішують мішалкою і аерують з інтенсивністю 16 м³/ (м³· ). Об'єм посівного матеріалу із другої стадії складає 0,5-1,0 % до об'єму поживного середовища в їнокуляторі.

Посівну культуру продуцентів 466 або ВУД Т-2 можна виро-

щувати за спрощеною схемою приготування спорового замість вегетативного по­сівного матеріалу. Вихідну культуру пересівають з пробірки на агаризованому поживному середовищі в колби зі стерильними висівками, які витримують в тер­мостаті до повного дозрівання культури. Безпосередньо з колб посівний матеріал у вигляді водної суспензії спор пересівають у виробничий ферментатор. Трива­лість вирощування виробничої культури при цьому не збільшується при високій активності культури.

Культивування на всіх стадіях проводять при оптимальних температурі, інте­нсивності аерації і тривалості процесу. Посівний матеріал не повинен бути інфіко­ваний контамінуючою мікрофлорою, в ньому мають зберігатися стійкі властивості продукування ферментів.

Промислове вирощування культури. Процес вирощування глибинної куль­тури у виробництві здійснюють у ферментаторі з нержавіючої сталі в стерильних умовах при постійному перемішуванні й аеруванні середовища.

Процес проводять періодичним способом постадійно: підготовка ферментато­ра до прийому поживного середовища, приготування поживного середовища, сте­рилізація поживного середовища, охолодження і засів поживного середовища в ферментаторі, ферментація.

Розглянемо технологічну схему глибинного культивування для

виробництва ферментного препарату Глюкаваморин Гх-466 (рис. 4.9).

Посівний матеріал готують у виробничому інокуляторі 23, який має аератор, мішалку й оболонку для охолодження.

Живильним середовищем є кукурудзяне сусло (або інших зернових культур), яке готують у змішувачі 15 і яке містить 6% сухих речовин. У змішувач 15 набирають воду і при постійному перемішуванні перекачують насосом 19 сусло з оцукрювача. Співвідношення сусла і води повинно бути 1:2. Після ретельного перемішування живильне середовище нагрівають у контактній головці до 85° С шляхом багаторазо­вого перкачування насосом 16.

Підігріте середовище передають у підготовлений посівний апарат. Для запобі­гання утворення піни перед підігрівом у середовище додають соняшникову олію з розрахунку 0,10...0,15 % його об'єму.

У посівному апараті 23 середовище спочатку підігрівають до 100° С гострою парою, яку подають через форсунку, лінію передавлювання і нижній спускний шту­цер при відкритій вихлопній повітряній лінії. Потім вентиль на вихлопній лінії закривають, і температура середовища піднімається до 121-123° С (тиск 0,1... 0,15 МПа витримують впродовж 1 год). Після закінчення стерилізації тиск в апараті поступово знижують до 0,03...0,05 МПа. Потім в апарат подають стерильне повіт-

Рис. 4.9 Апаратурно-технологічна схема виробництва Глюкаваморину Гх-466: 1 - фільтр грубого очищення; 2 - компресор; 3 - вологовідділювач; 4, 21 - тепло­обмінники; 5 - масловідділювач; 6, 22, 25 - фільтри; 7 - шнек для подачі муки; 8 - змішувач; 9, 16, 19, 27, 29 - насоси; 10 - варильний апарат; 11 - оцукрговач; 12 - солододробарка; 13 - збірник солодового молока; 14 - дозатор; 15 - змішу­вач; 17, 18 - контактні головки; 20 - стерилізатор; 23 - інокулятор; 24 - фермен­тер; 26 - збірник піногасника; 28 - скрубер

ря для підтримання надлишкового тиску в ньому 0,02...0,03 МПа, а в охолоджува­льну оболонку апарата поступає холодна вода.

Після охолодження маси до 27° С живильне середовище засівають культурою, одержаною на другій стадії, в кількості 0,5... 1,0 % через посівний люк з додержан­ням стерильних умов.

Режим вирощування посівного матеріалу: тиск в апараті 0,02...0,03 МПа, тем­пература 27...28° С, інтенсивність аерування 16 м³ / (м³ • год), частота обертів мішалки 5,8 с^-1. Тривалість вирощування посівного матеріалу 24 год.

Через 12 год після початку вирощування і перед посівом у ферментер у стери­льних умовах з апарата відбирають проби для визначення рН, контамінуючої мік­рофлори, концентрації сухих речовин.

Глибинну культуру вирощують у ферментері в стерильних умовах при безпе­рервному перемішуванні й аеруванні середовища.

Процес вирощування глибинної культури складається з таких стадій: підгото­вка ферментера до внесення живильного середовища, приготування живильного середовища, його стерилізація, охолодження і засів живильного середовища посів­ною культурою в ферментері, ферментація.

Ферментер 24 має пароводяну оболонку, аератор, патрубки для підводу пари, посівну і спускну лінії, гільзу для термометра, штуцер для манометра, паровідбір-ник, піногасний збірник та Індивідуальний повітряний фільтр.

Підготовка ферментера до внесення живильного середовища включає миття, огляд, перевірку герметичності і стерилізацію при температурі 120...125 ⁰С впро­довж 60 хв.

Після зняття тиску й охолодження до температури 27...28° С в ферментер по­дають живильне середовище.

Для приготування живильного середовища використовують кукурудзяне (або пшеничне) сусло з концентрацією сухих речовин 18...20 %, яке одержують за та­кою схемою: кукурудзяну муку через порційні автоматичні ваги шнеком 7 заванта­жують у змішувач 8, в який одночасно і при постійній роботі мішалки подають воду температурою не більше 45° С. Співвідношення муки і води 1:(2,5...3,0).

Одержану масу насосом 9 перекачують у варильний апарат 10, який працює під тиском. Масу в апараті нагрівають гострою парою, яку підводять знизу. Розварюван­ня проводять при температурі 143...145° С, тиску 0,3...0,4 МПа протягом 15 - 20 хв. Розварена маса поступає в оцукрювач 11, обладнаний змійовиком для охоло­дження. Перед подачею маси в оцукрювач додають воду в кількості 5 % об'єму розвареної маси.

Розварену масу охолоджують до 63° С й оцукрюють солодовим молоком, яке одержують змішуванням у ємностях 13 подрібненого на дробарці 12 солоду і води. Співвідношення солоду і води 1:(6...8). Тривалість оцукрювання при температурі 58...60⁰ С складає ЗО хв.

Живильне середовище концентрацією сухих речовин 18... 20 %, рН 5,3...5,6 і температурою 75...80° С із оцукрювача 11 насосом 19 подають через контактну голі­вку 18, де воно нагрівається до 120...125° С, в трубчатий стерилізатор 20, де витриму­ється 30...40 хв, потім охолоджується в теплообміннику 21 до 35° С і поступає в ферментер, у якому в процесі заповнення підтримується тиск 0,1...0,12 МПа.

Після заповнення ферментера всю систему звільняють від середовища, проми­вають водою і стерилізують парою впродовж 30...40 хв при 0,20... 0,25 МПа. При звільненні та прокачці системи живильне середовище і вода спускаються в змішувач 15. Витрати води при цьому повинні в 2...3 рази перевищувати об'єм системи.

Середовище засівається в ферментер лінією передавлювання, попередньо про­стерилізованою гострою парою впродовж 1 год.

Перед засівом із ферментера відбирають проби середовища через пробовідбі­рник для мікробіологічного висіву (на м'ясо-пептонний бульйон або м'ясо-пептон-ний агар) і біохімічного аналізу. На вихідній повітряній лінії біля посівного апарата закривають вентиль і піднімають тиск до 0,06...0,08 МПа, а в ферментері залиша­ють тиск 0,02...0,03 МПа. Після цього відкривають вентиль на лінії передавлюван­ня посівного апарата в ферментер, і посівна культура в результаті різниці тисків поступає в ферментер. Закривають вентиль на лінії передавлювання, включають змішувач і починають процес вирощування культури в ферментері. Кількість посі­вного матеріалу складає 3 % об'єму живильного середовища в апараті.

Режим вирощування культури: температура 34... 35° С, тиск 0,02...0,03 МПа, інтенсивність аерування 30...60 м³/(м³ • год), частота обертів мішалки 2,5...2,8 с^-1, тривалість вирощування 120-160 год.

Необхідно строго слідкувати за стерильністю повітря для аерування. Від ме­ханічних домішок і мікроорганізмів повітря очищується за допомогою систем по­трійного очищення, для цього перед компресором встановлюють висциновий фільтр грубого очищення 1.

Повітря подають компресором 2. Волога і масло відділяються з повітрям в відділювачі вологи 3 і масловідділювачі 5.

У теплообміннику 4 повітря підігрівається до 60... 80° С в залежності від тем­ператури зовнішнього повітря. Очищення повітря від мікрофлори проходить в за­гальному (головному) фільтрі 6, який заповнений базальтовим волокном. Після цього фільтру повітря поступає в колектор, а потім додатково очищується в індивідуаль­них фільтрах 22 і 25, які заповнені базальтовим волокном і встановлені відповідно перед кожним маточником і ферментером.

Індивідуальні фільтри стерилізуються разом з посівним апаратом і ферменте­ром гострою парою впродовж 2 год при тиску 0,18...0,20 МПа. Волога із фільтрів видаляється продуванням через них гарячого повітря.

Необхідно систематично контролювати стерильність повітря, що поступає на ае­рування. Для перевірки стерильності повітря колбу місткістю 0,5... 1,0 л з 100...150 мл стерильного м'ясо-пептонного бульйону стерильно приєднують до спеціального проб­ного крану повітропроводу і продувають повітря через м'ясо-пептонний бульйон впро­довж 10... 12 год, в цьому процесі бульйон не повинен сильно пінитися. Потім щільно зажимають шланги виходу і входу повітря, закривають пробний кран повітропроводу, від'єднують колбу і витримують її в термостаті при 37 + 0,5° С впродовж 48 год. Наяв­ність навіть незначного помутніння вказує на нестерильність повітря.

Для мікробіологічного і біохімічного контролю розвитку культури з дотри­манням усіх умов стерильності відбирають проби із ферментера: на початку через 72 год після посіву, а потім через кожну добу росту. У пробах визначають глюкоамі-лазну активність, рН, концентрацію сухих речовин, стерильність, стан культури.

Готовий ферментний препарат Глюкаваморин Гх повинен відповідати таким вимогам: активність глюкоамілази не менше 200 од./см³; концентрація сухих речо­вин у фільтраті 8...10%; рН 3,0...3,5; контамінуюча мікрофлора відсутня.

У випадку розвитку контамінуючої мікрофлори ферментер стерилізують про­тягом 2 год при 126...133° С і тиску 0,18...0,20 МПа, а препарат подають на мікрофі-льтраційну систему. Інфікування ферментера не допускається.

Готовий препарат насосом подають у стерильні збірники, в яких є система охолодження до 8... 12° С.

На такій же установці можна отримувати і інші ферментні препарати: Аміло-діастатин Гх, Глюкобататин Гх, Амілорізин Гх та ін. Відмінності, зумовлені біоло­гічними особливостями мікроорганізмів, полягають у різних способах ведення по­сівного матеріалу і технологічних режимах вирощування мікроорганізмів, різному складові живильних середовищ.

----------------------------------------- Одержання солоду та мікробних ферментних препаратів-------------

Після закінчення ферментації в ферментер при перемішуванні додають 40 %-ний розчин формаліну з розрахунку 2 л на 1 м³ культуральної рідини. Після цього препарат перекачують у розхідні збірники.

Витрати глибинної культури мікроорганізмів, а також концентрованих ферме­нтних препаратів на оцукрювання розвареної маси розраховують за їх активністю.

Ферментний препарат 466 має незначну кількість -аміла-

зи, тому його необхідно використовувати в суміші з іншими препаратами -аміла­зи, наприклад, Амілосубтиліном Гх. Витрати ферментів розраховують за нормами в одиницях активності на 1 г перероблюваного крохмалю сировини. Ці витрати змінюються в залежності від прийнятої тривалості бродіння. При 72-годинному бродінні витрати -амілази складають 1,5... 2,0 од. АЗ, глюкоамілази - 6 од. на 1 г крохмалю. При 48-годинному бродінні витрати -амілази залишаються такі ж, а глюкоамілази збільшуються до 15 од. ГлА на 1 г крохмалю. У цьому випадку дося­гають рівних показників дозрілої бражки.

Ферментний препарат можна використовувати і в суміші з солодом. Напри­клад, при 72-годинному бродінні і витратах зерна на солод 5 % маси переробленого крохмалю необхідно 4 од. ГлА на 1 г крохмалю.

Найбільш ефективний спосіб концентрування глибинних культур - це ультра­фільтрація.

Контрольні питання і завдання

1. Характеристика оцукрюючих матеріалів.

2. Механізм дії ферментів.

3. Кінетика ферментативних реакцій.

4. Класифікація і номенклатура ферментів.

5. Які умови замочування і пророщування зерна.

6. Технологія солоду з механоактивацією ферментів.

7. Глибинний спосіб культивування мікроорганізмів - продуцентів ферментів.

РОЗДІЛ 5