Основний дослід реакції зв‘язування комплементу (РЗК) з метою серологічної діагностики кашлюку»

Компонети РЗК:

1. Сироватка крові дослідної людини Дослідна система

2. Специфічний антиген

3. Комплемент

4. Еритроцити барана Індикаторна (гемолітична) система

5. Гемолітична сироватка

Принцип РЗК:

Реакція проходить у дві фази. Перша фаза - взаємодія антигену і антитіл за обов'язкової участі комплементу. Друга - виявлення результатів реакції за допомогою індикаторної гемолітичної системи (еритроцити барана і гемолітична сироватка). Руйнування еритроцитів гемолітичною сироваткою відбувається лише у разі приєднання комплементу до гемолітичної системи. Якщо ж комплемент адсорбував раніше на комплексі антиген-антитіло, то гемоліз еритроцитів не настає.

Результат досліду оцінюють, відзначаючи наявність або відсутність гемолізу в усіх пробірках. Реакцію вважають позитивною при повній затримці гемолізу, коли рідина в пробірці безбарвна, і еритроцити осідають на дно, негативною - при повному лізисі еритроцитів, коли рідина інтенсивно забарвлена («лакова» кров). Ступінь затримки гемолізу оцінюють залежно від інтенсивності забарвлення рідини і величини осаду еритроцитів на дні (++++, + + +, + +, +).

Порядок поставлення демонстраційного досліду РЗК:

1. Реакцію проводити в 3 пробірках. Відтитровані інгредієнти (антиген, комплемент, гемолітичну сироватку) розвели фізрозчином таким чином, щоб робоча доза їх містилася в 0,5 мл.

2. Одночасно приготували 3% суспензію овечих еритроцитів. У додатковому ряді пробірок розвели інактивовану прогріванням (56⁰С – 30 хвилин) досліджувану сироватку.

3. При проведенні реакції спочатку змішали досліджувану сироватку, антиген і комплемент.

4. Суміш витримали при температурі 37⁰С впродож 40 хвилин.

5. Після зазначеного терміну в пробірку додали сенсибілізовану гемолітичну систему (2 мл гемолітичної сироватки + 2 мл 3% суспензії еритроцитів).

6. Пробірки знову струснули і помістили у термостат при 37⁰С.

Зробіть облік демонстраційної РЗК з метою серологічної діагностики кашлюку, результати досліду та висновок занесіть до таблиці.

Фази реакції	Інгредієнти, що беруть участь у реакції	Номера пробірок
1 - дослід	2 – контроль сироватки	3 – контроль антигену
1.	1.Дослідна сироватка, мл	0,5	0,5	-
2.Кашлюковий антиген у робочій дозі, мл	0,5	-	0,5
3.Комплемент у робочій дозі, мл	0,5	0,5	0,5
4.Ізотонічний розчин, мл	-	0,5	0,5
Інкубація у термостаті 370С впродовж 30 хвилин
2.	5.Гемолітична система, мл	1,0	1,0	1,0
Інкубація у термостаті 370С впродовж 30 хвилин
Облік результатів:
Рисунок:
Висновок	__________________________________________________ __________________________________________________ __________________________________________________ ___________________________________________________

 

Пряма реакція імунофлуоресценції, з метою діагностики холери.

Компоненти РІФ:

1. Дослідний матеріал від хворої людини (наприклад, для діагностики холери - випорожнення).

2. Люмінесцентна специфічна сироватка (наприклад, для діагностики холери – холерна люмінесцентна сироватка).

Принцип РІФ:

Імунофлюоресцентний метод є методом вибору для швидкого виявлення та ідентифікації невідомого мікроорганізму в досліджуваному матеріалі.

Аг (з матеріалу) + АТ (з сироватки, міченої флуорохромами) + електроліт = комплекс світиться в УФ-променях.

Для РІФ, часто використовують барвник ізотіоціонат флюоресцеїну – ФІТЦ.

При дослідженні цим методом використовують люмінесцентний мікроскоп.

Постановка РІФ:

· На мазок наносять 30 мкл розчину ФІТЦ мічених антитіл.

· Поміщають скло у вологу камеру і витримують при кімнатній температурі впродовж 20-25 хв. або в термостаті при 37°С впродовж 15 хв.

· Промивають скло у проточній водопровідній воді 2 хв, обполіскують дистильованою водою і висушують на повітрі.

· На висушений мазок наносять краплю рідини вмонтовуючи, мазок накривають покривним склом і мікроскопують з використанням люмінесцентного мікроскопа або люмінесцентної насадки до звичайного оптичного мікроскопу.

Зробіть облік демонстраційної РІФ з метою експрес-діагностики холери, результати досліду та висновок занести до таблиці.

Позитивний результат РІФ	Негативний результат РІФ
Рисунок
Висновок
_____________________________________ _____________________________________	______________________________________ ______________________________________