Ультраструктура и функция биологических

МЕМБРАН

В настоящее время с помощью всех новых методов исследования структуры биологических объектов установлено, что огромное значение в создании структуры клеток имеют мембраны (см. рис. 19). Мембраны окру­жают всю цитоплазму и отграничивают ее от окружаю­щей среды. Проникновение веществ в клетку и из клет­ки в большой степени зависит от свойств мембраны. Как отметил Д. Бернал, «только после образования мембра­ ны вокруг всей клетки мы действительно имеем то, что с полным правом может быть названо организмом». Кро­ме того, мембраны образуют оболочки всех органоидов и включений клетки: ядра, митохондрий, лизосом, аппа­рата Гольджи, эндоплазматического ретикулума.

124

Теории молекулярного строения клеточной мембраны вначале базировались на косвенных данных. Раньше ученые считали, что мембраны состоят только из липидов. Так, Овертон на основании того, что вещества, растворимые в липидах, легко проникают через клеточную мембрану, выдвинул в 1902 г. предположение, что она состоит из тонкого слоя липидов.

Свойства и химический состав мембраны часто изучаются на оболочках эритроцитов. Оболочки эритроцитов представляют собой мембраны, которые очень легко получить путем гемолиза эритроцитов в гипотоническом растворе. В 1925 г. Гортер и Грендел в довольно про­стых опытах с липидами, экстрагированными из мем­бран эритроцитов, обнаружили, что площадь монослоя, занимаемого липидами, вдвое больше суммарной площа­ди поверхности всех эритроцитов. Был сделан вывод, что липиды мембран расположены в виде бимолекуляр­ного слоя. Эта теория подкреплялась данными, получен­ными при измерении электрических параметров клетки, которые свидетельствовали о высоком сопротивлении клеточной мембраны (порядка 1000 Ом/см²). Столь вы­сокое сопротивление характерно для липидов, обладаю­щих малой проводимостью.

Однако многие данные свидетельствовали также о наличии в клеточной мембране белковых молекул. Например, такие свойства мембран, как растяжимость, эластичность и способность некоторых из них к сокращению, можно объяснить лишь наличием вмембране белков, причем фибриллярных белков. Кроме того, при

измерении поверхностного натяжения крупных клеток, например яиц морского ежа, было установлено, что поверхностное натяжение клеток сильно отличается от поверхностного натяжения липидов. Было предположено, что низкое поверхностное натяжение клеточной мем­браны обусловлено наличием белковых слоев, покрываю­щих липидные компоненты мембран. И действительно, добавление к модельной липидно-водной системе небольшого количества белка заметно снижает ее поверхностное натяжение.

На основе анализа приведенных данных Даниэлли и Давсон в 1935 г. предложили модель строения мембраны, которая не претерпела существенных изменений до нашего времени. Согласно этой модели (рис. 21), име­ются два слоя молекул фосфолипидов, которые распо-

125

молекула липида

молекула белка

ложены перпендикулярно поверхности мембраны. Гидрофильными концами молекулы липидов на­правлены наружу, а гидрофобными — к центру мембраны. Гидрофобные концы — это такие концы,

Полярная пора

Рис. 21. Схема строения клеточной мембраны по Даниэлли и Давсону.

которые не содержат по­лярных групп и не могут присоединять молекулы воды. Обычно гидрофоб­ный конец молекулы представлен насыщенной углеводородной цепью органической кислоты.

Гид­рофильные концы моле­кул фосфолипидов содер­жат полярные группы, которые способны взаимодействовать с дипольными молекулами воды и формировать гидратные оболочки.

 

На полярных группах молекул фосфолипидов мем­браны адсорбированы белковые цепочки, которые в фор­ме глобул покрывают двойной слой фосфолипидов с обе­их сторон, придавая ему тем самым известную эластич­ность и устойчивость к механическим повреждениям, а также низкое поверхностное натяжение. Полярные группы молекул глобулярных белков направлены нару­жу — в сторону водной фазы, а неполярные группы — в сторону липидов.

К полярным группам относятся аминная, карбо­ксильная, фосфатная, гидроксильная, карбонильная и некоторые другие.

Поскольку длина липидных молекул равна примерно 3 нм. а толщина монослоя белка не превышает 1 нм, то толщина клеточной мембраны оценивалась примерно в 8 нм.

При этом считалось, что на одну молекулу белка приходится приблизительно 75 — 90 молекул липидов.

Последующие электронномикроскопические исследо­вания подтвердили правильность этой модели. При иссле­довании ультраструктуры миелина Дж. Робертсоном в

126

Рис. 22. Схема строения элементарной мембраны.

А — по Дж. Робертсону (1059);     Б — современная модель (по Л. Хокину и

М. Хокиной, 1967).

1959 г. была выдвинута теория ординарной или уни­тарной мембраны. По его мнению, основной единицей всех мембранных структур клеток является трехслойная структура толщиной 7,5 — 9 нм. Эта элементарная мембрана состоит из одного бимолекулярного слоя фосфолипидов, покрытого с цитоплазматическои стороны слоем фибриллярного белка, а с наружной поверхно­сти — мукополисахаридами или мукопротеидами (рис. 22, А).

В настоящее время большинство ученых придерживается следующего представления о структуре мембран: двойной слой фосфолипидов расположен между двумя тонкими слоями молекул фибриллярного белка, которые в свою очередь окружены молекулами глобулярных бел­ков (рис. 22, Б). Белки, входящие в состав мембран, составляют 70 — 75% ее веса (по Гельману) и разде­ляются на структурные белки, не обладающие фермента­тивной активностью, и каталитические белки, которые обладают ферментативной активностью.

Способность структурного белка к построению мембран, по мнению Ю. А. Владимирова и Г. И. Клебанова, обусловлена тремя его свойствами: 1) способностью давать комплексы с липидами; 2) способностью стехио-

127

метрически взаимодействовать с другими белками¹; 3) способностью к агрегации, которая проявляется в образовании кристаллов, а вместе с фосфолипидами — в участии при образовании мембран.

В настоящее время в литературе широко обсуждается вопрос о природе сил, связывающих мембранные белки и формирующих мембраны. На основе изучения процессов агрегации структурного белка в зависимости от рН среды, ионной силы раствора и других факторов вышеназванные авторы пришли к выводу, что агрегация обусловлена гидрофобными взаимодействиями, скрепляющими субъединицы белка.

В настоящее время большой интерес исследователей вызывает изучение конформации белков мембран. В литературе высказывается предположение, что многие жизненно важные процессы, такие, как окислительное фосфорилирование, активный транспорт веществ, химические реакции при фотосинтезе, проведение нервного импульса, движение цитоплазмы и др., сопровождаются, а может быть, и вызываются изменением способа уклад­ки полипептидной цепи, т. е. изменением конформации белковых молекул в мембранах. Так, в опытах Кеннеди (1967) показано, что активный транспорт некоторых веществ (аминокислот и Сахаров) определяется изменением конформации специфических белков — переносчи­ков, вмонтированных в мембрану. В связи с этим про­водятся очень интенсивные исследования конформации белковых молекул мембран.

При этом применяются методы люминесцентного анализа, инфракрасной спектроскопии, измерения оптической активности и др.

Вторым химическим компонентом мембран являются липиды, составляющие от 20 до 30% их сухого веса. Наибольшая часть липидов представляет собой фосфолипиды, количество которых, например, в митохондриях может достигать 90% от содержания всех липидов. Наи­более распространен в биологических мембранах фосфотидилхолин, но в них содержатся также фосфотидилэтаноламин, фосфотидилинозит и др. Мембраны различ­ных клеток, а также различных органоидов в пределах

¹ Стехиометрическое взаимодействие означает такой процесс, при котором имеется вполне определенное количественное соотношение взаимодействующих частиц.

128

 

одной клетки могут обнаруживать значительное разли­чие в составе липидов.

Раньше считали, что роль фосфолипидов сводятся к
приданию мембранам физической структуры и низкой
проницаемости для многих веществ. В настоящее время

установлено, что фосфолипиды играют более активную роль. В исследованиях Л. Хокина и М. Хокиной было показано, что если стимулировать прохождение веществ через клеточные оболочки, то этот процесс сопровож­дается химическими изменениями фосфолипидов — изме­нением соотношения различных фосфолипидов в мем­бранах. Обнаруженая метаболическая активность фос­фолипидов представляет новое преспективное направлениеисследований.

В последнее время многими учеными развивается глобулярная теория строения мембраны. Во многих слу­чаях на электронных микрофотографиях препаратов мем­бран, полученных после некоторых видов «нежесткой» фиксации и контрастирования, обнаруживаются глобулярные структуры. На этом основании Шестранд счита­ет, что липидная фаза мембраны существует в виде глобулярных мицелл, представляющих комплекс липидных молекул, залитых в белковый матрикс. Другие уче­ные считают, что липидные глобулы не полностью окружены белками, а расположены между двумя слоями белка. Все же большинство исследователей (Шестранд Нильсон, Кавана и др.) склоняются  к точке зрения, согласно которой субъединицы (блоки) биологических мембран образованы липидными глобулами, полностью окруженными белками и стабилизированным гидрофоб­ным взаимодействием поверхностного слоя белковых мо­лекул. Эти блоки имеют форму правильных шестигран­ных или пятигранных призм диаметром 8 — 14 нм. Блоки располагаются упорядоченно на расстоянии 8 — 10 нм от центра к центру, образуя в совокупности мембрану. В целом мембрана стабилизирована гидрофобными бе­лок белковыми связями и белок-липидными взаимодей­ствиями. При этом считают, что мембрана не имеет статической организации: форма глобулы в зависимо­сти от функционального состояния мембраны может ме­няться и становиться или более вытянутой, или более уплощенной. В результате этого мембрана как бы «мер­цает» или «пульсирует». В зависимости от той формы, которую принимают глобулы, между ними могут возни-

Медицинская биофизика

129

кать поры, размеры которых варьируют. Превращение глобул из одной формы в другую происходит за счет химической энергии АТФ, освобождаемой содержащейся в мембранах АТФ-азой. По данным Кавана, изменение размеров мембраны не связано с наличием специальных сократительных белков, а обусловлено изменением взаимодействия на границе липид — белок.

На основании вышеизложенного некоторые исследователи приходят к выводу, что мембраны могут иметь два типа организации — слоистую и глобулярную, которые, возможно, могут переходить друг в друга.

В последнее время в нашей стране и за рубежом появляются сообщения о том, что в состав биологических мембран входят рибонуклеиновые кислоты (РНК), В. С. Шапот с сотрудниками выдвинули гипотезу, со­гласно которой РНК в липопротеидных комплексах мем­браны играет роль структурной основы, матрицы, на ко­торой собираются в определенном порядке белки. Этот порядок детерминируется нуклеотидными последова­тельностями РНК, которые «узнают» тот или иной белок.

Хорошая проницаемость мембран большинства кле­ток для воды и многих водорастворимых веществ позво­ляет предположить существование в мембранах особых отверстий — пор. Диаметр пор определяется косвенным путем по размеру водорастворимых молекул, которые еще способны проникать через мембрану. С помощью этого и других методов было установлено, что у боль­шинства клеток диаметр пор составляет 0,35 — 0,8 нм. Поры могут иметь структуру длинного извитого каналь­ца. Количество пор в мембране невелико. В эритроцитах, например, вся площадь, приходящаяся на их долю, со­ставляет примерно 0,06% от общей поверхности мем­браны.

Поры изнутри выстланы слоем молекул белка (см. рис. 21). Полярные группы молекул белка направлены в сторону отверстия поры, а неполярные вступают во взаимодействие с молекулами липидов. Благодаря наличию полярных групп в порах они обычно обладают электрическим зарядом, что оказывает большое влияние на процесс проникновения растворенных частиц через поры.

Мембрана представляет собой элементарную структу­ру клеток. Мембраны образуют клеточные оболочки и оболочки органоидов клетки. Мембраны различных ор-

130

ганоидов отличаются химическим составом и толщиной. Например, оболочки митохондрий, состоящие из пяти слоев белков и липидов, представляют собой дубликатуру элементарной мембраны.

В некотором отношении очень интересны мембраны лизосом. Как известно, лизосомы содержат ферменты, разлагающие все наиболее важные вещества клетки. Эти ферменты не могут только разлагать и переваривать свою собственную мембрану. При разрушении мембраны лизосом ферменты выходят в цитоплазму и наблюдается явление аутолиза — самопереваривания клетки.

В клетках протекает сложнейшая сеть биохимиче­ских превращений, состоящая из тысяч отдельных реакций. Все эти реакции должны быть тем или иным способом отграничены друг от друга. Мембраны производят   деление клетки на отдельные участки, фазы, где и про­текают различные реакции. И в самом деле, мембрана, как правило, располагается на границе раздела двух фаз: наружная плазматическая мембрана отделяет вну­треннюю среду клетки от наружной; мембраны митохонд­рий отделяют их матрикс от собственной цитоплазмы; мембраны ядра — кариоплазму от цитоплазмы; мембра­ны цитоплазматического ретикулума — содержимое ци­стерн от цитоплазмы и т. д. Все эти фазы отличаются друг от друга физико-химическими показателями: рН, концентрацией ионов, наличием ферментов, количеством воды, кислорода и т.д. Благодаря тому что мембраны создают границы раздела, возможно существование мно­гих биохимических реакций.

Помимо того что мембраны создают границы раздела между различными фазами, они принимают непосредст­венное участие во всех процессах обмена веществ, которые обусловливают жизнедеятельность клеток. Различного рода мембранные структуры в организмах составляют колоссальную поверхность — десятки тысяч квадратных метров. Такая обширная структурная систе­ма указывает на ее важное функциональное значение. Во всех мембранных структурах имеются ферментные сиситемы. Во внутренней мембране митохондрий и эндоплазматического ретикулума сосредоточены такиеокистельные ферменты, как дегидрогеназы, флавины, цитохромы. В мембранных образованиях находятся также фосфотазы, ферменты активного переноса веществ   (пермеазы), липолитические ферменты.

131

Приведенные данные убедительно свидетельствуют о том, что поверхность мембран представляет собой то место в клетке, где протекает большинство биохимиче­ских реакций. На это указывает и тот факт, что фер­мент АТФ-аза, играющий ключевую роль в обмене ве­ществ, локализован в основном на мембранах (кроме актомиозина, находящегося в саркоплазме).

Наконец, функция мембран заключается еще и в том, что они координируют и регулируют биохимические и биофизические процессы в клетках. Сейчас становится все более очевидным, что мембраны являются своеоб­разным устройством, воспринимающим сигналы, посту­пающие извне, и преобразующим их в команды, регули­рующие обмен веществ внутри клетки. В выполнении данной функции большое значение имеет такое свойство мембран, как проницаемость. В результате изменения проницаемости меняется скорость поступления и выведения веществ, изменяются стационарные концентрации реагирующих веществ в клетках и, следовательно, скоро­сти биохимических и биофизических процессов. На важное значение проницаемости мембран в регуляции обмена веществ указывает тот факт, что многие гормо­ны (инсулин, адренокортикотропный гормон, минерало-кортикоиды, антидиуретический гормон) оказывают био­логическое действие путем изменения проницаемости кле­точных мембран. Некоторые функции мембран более подробно будут рассмотрены в последующих главах.

Нормальное состояние мембран клетки нарушается при многих заболеваниях, в особенности связанных с нарушениями гормонального и витаминного баланса организма. Обнаружены увеличение проницаемости мембран лизосом и выход в цитоплазму лизосомных фермен­тов при гипервитаминозе А, авитаминозе Е, при гипок­сии, действии ионизирующих излучений, стрептолизина, эндотоксинов и т. п. Кортизон и гидрокортизон, напро­тив, способны стабилизировать мембраны лизосом, что, возможно, является одной из причин противовоспали­тельного действия этих соединений.

АДГЕЗИЯ КЛЕТОК

Клеточным мембранам принадлежит важная роль в обеспечении адгезии — сцепления клеток друг с другом, обусловливающего существование ткани. Соединение

132

клеток часто обеспечивается наличием на клеточных поверхностях специализированных структур, представленных выростами в стороны соседних клеток. В одних слу­чаях эти структуры создают чисто механическое заце­пление по типу: «гнездо — шип»; в других — между выростами, по-видимому, устанавливается химическая связь. Было обнаружено, что эмбриональные ткани, обработанные трипсином, распадаются на отдельные клетки. Так как трипсин действует на пептидные связи, то предположили, что последние могут играть роль связующего фактора. Наконец, предполагают, что межклеточ­ная жидкость содержит склеивающее цементоподобное вещество. Основой механизма склеивания может быть органическая соль кальция, соединяющаяся с карбо­ксильными группами белков и фосфатными группами липидов. Это подтверждается тем, что с понижением концентрации кальция в межклеточной жидкости спо­собность клеток к адгезии уменьшается.

Стабильность ткани зависит также от поверхностного заряда клеток. Наличие отрицательного заряда на поверхности клеток приводит к их взаимному отталкиванию, определяемому величиной электрокинетического потенциала (см. главу 8). Ткань является стабильной, если электрическое отталкивание клеток не превышает сил их сцепления.

Если действием трипсина вызвать полную дезагрега­цию тканей куриного эмбриона, то через некоторое время наблюдается слипание однотипных клеток с образованием агрегатов из клеток соответствующей ткани (кости, почек, печени). Если смешать клетки зародышей разных видов, то последующая их адгезия обусловливается не видовой специфичностью, а тканевой принадлежностью. По-видимому, самоорганизация клеток по их специфичности обусловлена локализованным на клеточной по­верхности специальным механизмом «узнавания себе подобных». Природа этого механизма еще не выяснена. Клетки различных тканей обладают не одинаковой способностью к адгезии. Способность к адгезии бывает ниже у малоспециализированных клеток. Клетки злокачественных опухолей не имеют специфичности и обла­дает более низкой способностью к адгезии, чем нормальные клетки. Пониженная способность к адгезии

133

может быть объяснена рядом причин. Поверхности опухолевых клеток обычно утрачивают

специализированные структуры, обеспечивающие механическую и химическую связь клеток. Содержание каль­ция в раковых опухолях снижено более чем в 2 раза по сравнению с нормальными тканями, что может быть причиной уменьшения сил межклеточного склеивания. Поверхностный заряд опухолевых клеток, определяе­мый по их электрофоретической подвижности, выше, чем у нормальных. Увеличение электрокинетического потенциала приводит, по-видимому, к тому, что возрос­шая сила электрического отталкивания опухолевых кле­ток перестает уравновешиваться силами взаимного сцеп­ления, которые, напротив, у опухолевых клеток понижены. Поэтому опухолевые клетки по сравнению с нор­мальными обладают более высокой подвижностью, они легко отрываются от опухоли, уносятся стоками жидко­сти и образуют метастазы.

ИСКУССТВЕННЫЕ МЕМБРАНЫ

Свойства мембран часто исследуются на искусственных фосфолипидных мембранах, представляющих собой модели естественных мембран. Техника получения ис­кусственных липидных мембран была разработана Лэнгмюром еще в 1917 г. Если на поверхность воды нанести каплю растворенных в каком-либо летучем растворителе фосфолипидов или жирных кислот, то после распределе­ния их молекул по водной поверхности и испарения растворителя образуется мономолекулярная пленка. Как установил Лэнгмюр, при полном насыщении поверхност­ного слоя адсорбированные молекулы липидов распола­гаются перпендикулярно к поверхности воды таким об­разом, что в воду погружается гидрофильная полярная группа, а неполярная углеводородная цепь направлена вертикально вверх. Такой ориентированный слой моле­кул называют «частоколом Лэнгмюра».

Если стеклянную пластинку опустить в воду, на поверхности которой находится мономолекулярная пленка липидов, то эту пленку можно перенести на поверхность пластинки. При повторных погружениях на пластинке возникают бимолекулярные и даже полимолекулярные пленки, молекулы отдельных слоев которых соединя­ются друг с другом либо полярными, либо неполярными группами.

134

 

Рис. 23. Процесс образования искусственной мембраны при диффузиирастворителя в водную, фазу из капли раствора липидов, нане­сенной на отверстие.

В 1962 г. Мюллер предложил более удобный способ для получения бимолекулярных пленок. Для этого берут тефлоновую пластинку с небольшим отверстием и на отверстие наносят каплю раствора липидов в смеси хлороформа с этанолом (рис. 23). Затем пластинку помещают в раствор хлорида калия. По мере диффузии растворителей из капли в водную фазу молекулы липидов по поверхностям сферы (на границах капли) прибли­жаются друг к другу и в конце концов соединяются в довольно стабильный двойной слой, закрывающий от­верстие. Такая мембрана может длительное время суще­ствовать в водных растворах солей, а также служить границей раздела солевых растворов различного состава.

После этого многие исследователи изучали электропроводность подобных мембран, транспорт через них ионов, их проницаемость для различных веществ, их гид­ратацию, а также их механические и оптические свойства. В результате этого выяснилось, что подобные би­молекулярные пленки являются хорошей моделью биологических мембран. Например, величины электрических емкостей и сопротивления таких мембран близки к величинам этих параметров клеточной мембраны. Если создавался концентрационный градиент через мембрану, то возникал потенциал покоя величиной порядка 150 мВ при 0,1 М растворах NаС1 и КСl на противоположных сторонах мембраны. В 1967 г. Мюллер и Рудин сообщил

что некоторые вещества (циклические антибиотики)

135

увеличивают электропроводность искусственных мем­бран приблизительно в 1000 раз. В дальнейшем выясни­лось, что подобные вещества могут изменять проницае­мость мембран для ионов, а также и для неионизированных частиц.

В 1968 г. Мюллеру и Рудину при добавлении в си­стему белков удалось получить мембраны, обладающие электрогенными свойствами. Они предположили, что один белок образует в мембране катионпроводящие поры, а второй добавленный белок — анионпроводящие поры. Эти мембраны при действии электрического тока обладали способностью генерировать импульсы, подоб­ные потенциалам действия. Интересно, что ионы каль­ция блокировали ритмическое возбуждение мембран и повышали его порог, т. е. действовали так же, как и на клеточную мембрану. Возбуждение обратимо блокировалось также местными анестетиками группы кокаина в концентрации примерно 2%, что представляет особый интерес, поскольку это находится в области физиологи­ческих концентраций.

Таким образом, метод создания искусственных мембран позволяет изучать многие свойства клеточных мем­бран. Основная ценность этого метода заключается в том, что он позволяет более детально изучать сложные биофизические процессы в мембранах, поскольку исследования проводятся в сравнительно простых системах.

Ценность этого метода обусловлена также и тем, что на искусственных мембранах можно исследовать про­цессы самоорганизации биологических структур, которые пока еще очень слабо изучены и привлекают присталь­ное внимание ученых.