Часть вторая биофизика клетки

Глава 5

УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТКИ И БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

Вся сложность изучения процессов жизнедеятельно­сти организмов обусловлена не только сложными термодинамическими и кинетическими параметрами, отражаю­щими функциональные свойства живой материи, но и вы­сокой структурностью живого организма. Структурной и функциональной единицей живого организма является клетка, которой присущи все основные жизненные функ­ции. Клетка представляет собой открытую систему, ко­торая обменивается с окружающей средой веществом, энергией и информацией. Свободная энергия питатель­ных веществ расходуется в клетке на совершение раз­личного вида работ, на выполнение самых разнообразных функций. Регулирование всех функций клетки осу­ществляется на основе наследственной информации и информации, поступающей в клетку извне.

Все многообразные функции клетки тесно связаны с ее структурой. По существу, изучение ультраструктуры (тонкой структуры) клетки относится к функциональной морфологии: наблюдение структуры позволяет непосредственно понять функцию. Как отмечает В. Холличер, функция — это быстрое изменение структуры, а структу­ ра — это квазистатическая (медленно изменяющаяся,, застывшая) функция.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ультратонкие структуры клетки наиболее подробно были изучены в последние 15 лет благодаря развитию и применению новых методов исследования структуры в

118

 

сочетании со старыми методами гистохимии и био­химии.

Изучение клеточных структур началось с применения оптического микроскопа. Принцип его работы основан на явлении преломления света и на формировании изображения с помощью оптической системы линз. Разрешаю­щая способность микроскопа зависит от длины волны λсвета и численной апертуры А линз объектива. Пре­дел разрешения (т. е. минимальное расстояние между двумя точками, при котором они видны еще раздель­но, — величина, обратная разрешающей способности) определяется по формуле Аббе:

 

Длина волны света лимитирует предел разрешающей способности микроскопа. Учитывая, что максимальное значение А не превышает 1,4, можно вычислить, что при использовании белого света (λ=550нм) предел разре­шения будет равен 250 нм. Если использовать фиолето­вые лучи ( λ = 400 нм), то предел разрешения будет равен 170 нм, а при использовании ультрафиолетовых лу­чей (λ = 200—300 нм) — 100 нм, что является пределом светового микроскопа. Для наблюдения ультраструктур клетки, имеющих размеры на порядок меньше, этого явно недостаточно.

У обычного светового микроскопа есть еще один недостаток: он дает недостаточно контрастное изображение. Чтобы получить контрастное изображение приме­няют методы фазово-контрастной и интерференционной микроскопии, позволяющие изучать структуру нефиксированных клеток.

Возможность непосредственного изучения биологических ультраструктур появилась после изобретения электронного микроскопа. Его разрешающая способность значительно выше, чем у светового микроскопа. Предел разрешения современных электронных микроскопов со­ставляет 0,5—1 нм, а увеличение — сотни тысяч раз. Ход лучей в световом и электронном микроскопах в принципе одинаков. Но роль пучка света в электронном микроскопе выполняет поток электронов, а роль линз — электростатическое или электромагнитное поле. Цен­ность метода электронной микроскопии несколько сни­жается из-за того, что препараты для исследования не-

119

обходимо высушивать, фиксировать и контрастировать солями тяжелых металлов.

Очень большое значение в изучении структур клетки и макромолекул имеет метод рентгеноструктурного анализа (дифракции рентгеновских лучей). Метод основан на явлении дифракции. Дифракция наблюдается в тех случаях, когда на пути лучей имеются препятствия, сравнимые по размерам с длиной волны лучей. Метод рентгеноструктурного анализа заключается в том, что на исследуемый объект направляют параллельный пучок рентгеновых лучей. За объектом помещают фотопленку, на которой регистрируется получающаяся дифракцион­ная картина. На рентгенограмме можно увидеть множе­ство пятен (дифракционных максимумов), образующих­ся в результате интерференции дифрагированных лучей. Из анализа рентгенограммы получают данные о струк­туре объекта на молекулярном и даже атомном уров­нях. Вначале описанный метод был применен для изуче­ния структуры кристаллов, а затем и для исследования других периодических структур. Этот метод является од­ним из самых мощных методов, применяемых в области молекулярной биологии и при изучении ультраструктур. Его ценность состоит в том что он дает возможность не только определять пространственное расположение молекул, но и точно измерять расстояние между ними

и даже выявлять их внутримолекулярную организацию. Особое достоинство метода, обусловливающее его преимущество по сравнению с электронной микроскопией, заключается в том, что он позволяет анализировать структуру нефиксированных препаратов.

В последнее время большое значение приобрели методы разделения клеток на отдельные фракции. Большинство методов фракционирования основано на гомо­генизации ткани (получении однородной клеточной мас­сы) или механическом разрушении клеток различными способами с последующим разделением субклеточных фракций по их относительной плотности, массе и т.д. на препаративных и аналитических центрифугах. Эти методы применяются в совокупности с электронным микроскопированием и рентгеноструктурным анализом.

При исследовании химического состава клеток применяются различные методы ультрахимии. Эти методы основаны на получении вещества из клетки в очень не­больших количествах. С помощью микропипеток, а так-

 

120

 

 

же другими способами получают содержимое клетки, её отдельных частей и органоидов. В последующем производят качественный и количественный анализ получен­ных веществ специальными химическими методами. К этой же группе методов относятся и методы разбор­ки мембран на составные компоненты путем экстраги­рования белков или липидов.

ОБЩАЯ СТРУКТУРА КЛЕТКИ

Несмотря на то что клетки у животных и растений очень специализированы и вследствие этого крайне разнообразны, существуют единые принципы построения всех клеток. Все клетки состоят из цитоплазмы, окру­женной плазматической (клеточной) мембраной. В ци­топлазме находятся ядро, органоиды клетки и различные включения (рис. 19). К органоидам клетки относятся митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум, рибосомы.

В некоторых клетках клеточная мембрана покрыта более толстыми защитными слоями, которые находятся в пределах разрешающей способности оптического микроскопа. Например, у большинства растительных клеток имеется толстая целлюлозная оболочка, окружающая и защищающая истинную клеточную мембрану. Животные клетки также могут иметь наружные оболоч­ки, состоящие из полисахаридов или гликопротеидов. Помимо функции механической защиты клетки, эти обо­лочки выполняют и другие функции, так как обладают иммунологическими свойствами, фильтрационными свой­ствами (пропуская к поверхности клеток лишь молеку­лы определенного размера) и ионообменными свойства­ми (участвуя в сохранении постоянства микросреды, ок­ружающей клетку).

В состав цитоплазмы входят различные вещества: белки, липоиды, углеводы, органические кислоты, витамины, электролиты, вода и др. В среднем в цитоплазме содержится 75—85% воды, 10—20% белков, 2—3% ли­пидов, 1% углеводов и около 1% солей и других ве­ществ.

Вода, находящаяся в клетке, выполняет следующие основные функции: 1) служит растворителем органических и неорганических веществ; 2) служит дисперсион-

121

Рис. 19. Схема строения животной клетки, основанная на наблюдениях в электронном микроскопе.

ной средой коллоидных систем; 3) участвует в метаболизме клетки (поступление веществ, химические процес­сы, выведение продуктов обмена); 4) участвует в термо­регуляции; 5) создает тургор клеток.

В молекуле воды валентный угол (угол между связя­ми атомов водорода с атомом кислорода) равен пример­но 109° (рис. 20). Поэтому молекула воды приобретает характер диполя с большим дипольным моментом, кото­рый определяет высокое значение диэлектрической проницаемости воды.

Благодаря дипольным свойствам, молекулы воды взаимодействуют друг с другом и образуют динамиче­скую структуру. Современными методами установлено, что внутриклеточная вода находится в своеобразном со-

122

стоянии непрерывно идущих микрофазовых переходов:

крис­талл—> жидкость,

жидкость—> кристалл.

Большой    диэлектрической

Рис. 20. Схема возникновения полярности в молекуле воды за счет асимметрии ковалентных связей.

проницаемостью воды объясняет­ся ее способность растворять по­лярные вещества. Так как все химические

связи по своей сущности являются силами электроны убывают в 80 раз (диэлектриче­ская проницаемость воды равна 80 при 20 °С).

При этом молекулы электролитов распадаются на ионы, вокруг ко­торых формируются гидратные оболочки. Растворение полярных недиссоциирующих веществ также обуслов­лено взаимодействием полярных групп молекул с дипо­лями воды. В результате того что молекулы воды пред­ставляют собой диполи, вода служит не только раство­рителем, но и играет значительно более важную роль, определяя структуру раствора.

Вода в клетке делится на свободную и связанную. Свободная вода составляет 95% всей воды клетки (по Э. де-Робертису) и используется главным образом как растворитель и как дисперсионная среда коллоидной си­стемы цитоплазмы. Молекулы связанной воды, на долю которой приходится всего 4 —5% всей воды клетки, об­разуют слабые связи (водородные и вандерваальсовы) с полярными группами различных молекул (в основном белков). Так, каждая аминогруппа в белковой молекулекуле способна связать 2,6 молекул воды. Движение молекул воды, связанных белками, ограничено, и связанная во­да не может служить растворителем для других ве­ществ.

Количество воды, связанной белками, можно опре­делить путем измерения количества воды, адсорбирован­ной на высушенном белке. Кроме того, количество свя­занной воды определяется термодинамическими метода­ми, например методом Хилла — измерением упругости пара над тканью.

Вода клетки восполняется за счет поступления из межклеточной жидкости и частично за счет образования ее при окислительных процессах в клетке.

12 3

После удаления из клетки всех органоидов и всех включений, например путем ультрацентрифугирования клеточного гомогената, остается гомогенное (в оптическом микроскопе), аморфное, прозрачное вещество. Это оставшееся вещество называется гиалоплазмой. Она яв­ляется внутренней средой клетки.

В физико-химическом отношении гиалоплазма представляет собой многофазную коллоидную систему. Кол­лоиды цитоплазмы являются преимущественно гидрофильными коллоидами. Коллоидная система цитоплазмы образована сложными высокополимерными соединения­ми. Такими соединениями являются белки, полисахари­ды, нуклеиновые кислоты. Все эти соединения отличают­ся большой степенью полимеризации. В формировании структуры гиалоплазмы принимают участие и липиды, создающие своеобразную коацерватную систему.

Коллоиды цитоплазмы могут находиться в состоя­нии золя или геля, между которыми имеются переход­ные состояния. В цитоплазме все время происходят пе­реходы из одного состояния в другое. В разных участ­ках клетки эти переходы несинхронны. Кроме того, ци­топлазма постоянно находится в движении. В резуль­тате этого вязкость ее непрерывно изменяется. В клет­ке нет ни одного физико-химического показателя, кото­рый мог бы сравниться с вязкостью в непостоянстве.