Медицинская биофизика 193

браны заняты в основном двухвалентными катионами (кальцием) из внешней среды. При действии раздражителей двухвалентные катионы вытесняются одновалентными и внутри мембраны происходит фазовый переход. Он приводит к изменению ультраструктуры мембраны и ее физико-химических свойств, в результате чего становится возможным возникновение и развитие потенциала действия.

ПЕРЕДАЧА ВОЗБУЖДЕНИЯ В СИНАПСАХ

Передача возбуждения с одной нервной клетки на другую и с нервной клетки на эффекторный элемент осуществляется специальными образованиями — синапсами, которые являются функциональными контактами между двумя клетками. Нервное окончание, входящее в состав синапса, утолщено и обычно имеет вид бляшки (рис. 34). Мембрана на конце волокна, с которого передается возбуждение, называется пресинаптической. Мембрана другой клетки, на которую передается возбуждение, называется 'постсинаптической. Пространство между пресинаптической и постсинаптической мембранами, называемое синаптической щелью, имеет ширину 20 — 30 нм. Оно заполнено межклеточной жидкостью.

Передача возбуждения в синапсах может происходить двумя способами: электрическим и химическим. Электрическая передача возбуждения заключается в том, что потенциал действия на пресинаптической мембране служит раздражителем для постсинаптической мембраны. Чтобы эта передача могла осуществляться, синапсы должны иметь сравнительно большую площадь контакта. Кроме того, при таком способе передачи пре-синаптическая и постсинаптическая мембраны обычно сближены и даже могут соприкасаться. Передача возбуждения электрическим путем встречается редко и в основном у низших животных: кишечнополостных, червей, ракообразных. Электрическая передача возбуждения наблюдается в гладких мышцах и мышце сердца.

Химическая передача возбуждения осуществляется с помощью особых биологически активных веществ — медиаторов, из которых наиболее известны ацетилхолин и норадреналин. Медиаторы содержатся в синаптических пузырьках, локализованных в пресинаптическом оконча-

194

нии. Когда на пресинаптическом волокне возникает потенциал действия, то медиатор выходит в синаптичеекую щель и диффундирует к постсинаптической мембране, обладающей очень высокой чувствительностью к нему. Под влиянием медиатора изменяется проницаемость мембраны для ионов натрия и калия, вследствие чего она деполяризуется. Это изменение мембранного потенциала называется возбуждающим постсинаптическим потенциалом.

Постсинаптические потенциалы имеют сравнительно небольшую продолжительность, поскольку медиатор быстро расщепляется соответствующим ферментом, и не распространяются по клетке.

Катцем было установлено два важных отличия свойств постсинаптической мембраны от свойств мембраны в других участках клетки. Во-первых, постсинаптическая мембрана под действием медиатора становится одинаково проницаемой для натрия и калия. Поэтому постсинаптический потенциал не превышает потенциала покоя. Во-вторых, проницаемость постсинаптической мембраны не является функцией мембранного потенциала и, следовательно, постсинаптический потенциал не подчиняется закону «все или ничего». Величина постсинаптического потенциала пропорциональна количеству поступившего медиатора. Когда постсинаптический потенциал достигает определенной величины, то в соседних с синапсом участках мембраны генерируются потенциалы действия, передающие возбуждение по клетке.

Частота появления потенциалов действия пропорциональна величине постсинаптического (генераторного) потенциала.

Существование стадии постсинаптических потенциалов является одним из условий трансформации ритма в синапсах.

Природа изменений проницаемости постсинаптичекой мембраны при действии медиаторов окончательно

13* 195

еще не выяснена. Наиболее изученным в этом отношении является действие на мембрану ацетилхолина. Высокая чувствительность мембраны к ацетилхолину обусловлена наличием в ней особого холинорецептора. В настоящее время показано, что холинорецептор является белковой молекулой, адаптированной к взаимодействию с ацетилхолином. Михельсоном установлено, что холинорецептор имеет два активных участка. Анионный участок холинорецептора устанавливает ионную связь с катионной головкой ацетилхолина, а второй участок осуществляет диполь-дипольное взаимодействие с поляризованной частью' молекулы ацетилхолина. В результате взаимодействия ацетилхолина с холинорецептором происходит изменение конформации последнего и увеличение проницаемости мембраны для ионов (Нахманзон, Михельсон).

Чувствительность мембраны к ацетилхолину можне сильно уменьшить с помощью ряда веществ, из которых наиболее известно кураре. Кураре конкурирует с ацетилхолином в отношении связывания с холинорецептором.

Это явление аналогично конкурентному торможению ферментов: ацетилхолин аналогичен нормальному субстрату, а кураре — конкурентному ингибитору.

В тех синапсах, где медиатором служит норадреналин или адреналин, Никерзоном в 1965 г. обнаружена субстанция — адренорецептор, адаптированный к взаимодействию с данными медиаторами. По-видимому, взаимодействие медиатора с соответствующим рецептором по принципу комплементарности является общей закономерностью химической передачи возбуждения в синапсах.

Кроме возбуждающих синапсов, вызывающих деполяризацию мембраны, в нервной системе существуют тормозные синапсы, которые при активизации вызывают гиперполяризацию постсинаптической мембраны и понижение активности клетки. Эта гиперполяризация обозначается как тормозной постсинаптический потенциал.

Дж. Экклс в 1964 г. показал, что в тормозных синапсах медиатор открывает в постсинаптической мембране поры, проницаемые для ионов калия и хлора. Диффузия этих ионов приводит к гиперполяризации мембраны и к торможению клеток.

196

Глава 8 ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИЕ ЯВЛЕНИЯ

Биологические объекты представляют собой сложные гетерогенные системы со множеством границ раздела. С одной стороны, отдельная клетка представляет собой коллоидную гетерогенную систему, образованную высокомолекулярными и низкомолекулярными соединениями. С другой стороны, ткань можно считать гетерогенной системой более высокого порядка, где дисперсная фаза и дисперсионная среда представлены соответственно клетками и окружающей их жидкостью. С этой точки зрения изучение электрокинетических явлений, протекающих в биологических системах, представляет большой интерес при исследовании структур и биологических поверхностей.

К электрокинетическим явлениям относят движение фаз гетерогенной системы друг относительно друга при наложении внешнего электрического поля,или же возникновение разности потенциалов в системе при механическом движении фаз под действием каких-либо сил. К таким явлениям относятся электрофорез, электроосмос, потенциалы течения (протекания) и потенциалы оседания (седиментации).

ВОЗНИКНОВЕНИЕ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА

При определенных условиях между фазами гетерогенной системы на границе раздела возникает разность потенциалов. Для ее возникновения необходимо наличие двойного электрического, слоя. Образование его связано с возникновением на поверхности дисперсной фазы свободных электрических зарядов. Электрические заряды на поверхности коллоидных частиц или на поверхности клеток и клеточных органоидов могут возникать в результате двух процессов: диссоциации ионогенных групп и адсорбции ионов дисперсионной среды на поверхности дисперсной фазы, которая сама не способна образовывать ионы.

Возникновение поверхностного заряда за счет ионизации может, например, происходить в белках и других

197

органических электролитах, содержащих карбоксильные, аминные и другие полярные диссоциирующие группы. В белковых молекулах возникновение заряда зависит от наличия кислотных и щелочных группировок. Кислотные группировки в молекуле белка создаются, помимо концевых аминокислот, дикарбоновыми аминокислотами, щелочные — диаминомонокарбоновыми кислотами. Благодаря наличию кислотных и щелочных групп белки представляют собой биполярные ионы. В кислых растворах белок играет роль катиона.

Например, при действии НС1 происходит реакция:

При действии NаОН происходит такая реакция:

В результате ионизации групп NH₂ и СООН одни ионы — так называемые противоионы — уходят в дисперсионную среду, а другие — потенциалообразующие ионы — остаются фиксированными на поверхности, содержащей данные молекулы белка. Поверхность, содержащая белки, будет иметь, таким образом, заряд того знака, который имеют потенциалобразующие фиксированные ионы (NНз⁺ в первом случае и СОО- — во втором), а дисперсионная среда будет иметь заряд, создаваемый противоионами. Такая группа (система) ионов, в целом нейтральная, называется двойным электрическим слоем.

Вторым процессом, ведущим к образованию двойного электрического слоя, является адсорбция ионов поверхностью дисперсной фазы из дисперсионной среды. Адсорбция ионов может происходить на полисахаридах, липидах, холестерине, белках. Адсорбция ионов сильно связана с наличием полярных недиссоциирующих групп: гидроксильных, карбонильных, пептидных и пр. Адсор-

198

бироваться могут как катионы, так и анионы, однако преимущественно адсорбируются анионы, что связано с их меньшей степенью гидратации. Ионы, которые адсорбируются поверхностью, являются потенциалобразу-ющими — от них зависит знак заряда поверхности; в дисперсионной среде остаются противоионы, которые и определяют ее заряд.

Структура двойного

электрического слоя не зависит от механизма возникновения заряда на поверхности, т. е. от того, происходит ли образование заряда путем диссоциации ионогенных групп или за счет адсорбции ионов из раствора.

Но современным представлениям, двойной электрический слой имеет примерно следующее строение. Часть ионов находится на молекулярном расстоянии от поверхности, образуя плотный гельмгольцевский слой. Этот слой состоит из потенциалообразующих ионов и некоторой части противоионов (рис. 35, а). Противоионы удерживаются на поверхности частицы силами специфической адсорбции, поэтому этот слой называется адсорбционным слоем. Противоионы адсорбционного слоя всегда перемещаются вместе с частицами дисперсной фазы. Остальная часть противоионов, не находящихся в адсорбционном слое, остается в дисперсионной среде и образуется так называемый диффузионный слой. Диффузионный слой может отставать от движения частицы с адсорбционным слоем.

Полная разность потенциалов Е (рис. 35, б) между дисперсной фазой и дисперсионной средой называется полным электротермодинамическим потенциалом. Разность потенциалов ξ (ξ-потенциал) между адсорбционным слоем и дисперсионной средой называется электрокинетическим потенциалом, ξ-потенциал всегда меньше термодинамического потенциала, и это уменьшение

199

обусловлено присутствием части противоионов в адсорбционном слое (по существу в дисперсной фазе).

Любые факторы, влияющие на строение двойного электрического слоя, изменяют величину ξ-потенциала. При увеличении концентрации ионов в дисперсионной среде толщина диффузионного слоя уменьшается и уменьшается ξ-потенциал. Если двойной электрический слой возникает в результате диссоциации ионогенных групп, то величина электрокинетического потенциала в большой степени будет зависеть от рН дисперсионной среды.

Электрокинетический потенциал возникает в очень тонком слое жидкости, прилегающем непосредственно к поверхности дисперсной фазы, поэтому его нельзя зарегистрировать с помощью электродов. Величину ξ-потенциала можно рассчитать только косвенно, по скорости движения фаз в электрическом поле.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Если к гетерогенной системе приложить постоянную разность потенциалов, то фазы этой системы придут в движение вследствие взаимодействия с электрическим полем. Движение частиц дисперсной фазы в электрическом поле по направлению к противоположно заряженному электроду называется электрофорезом. Электрофорез был открыт Ф. Рейссом в 1807 г.

Скорость передвижения частиц дисперсной фазы можно найти из уравнения Смолуховского:

где v — скорость передвижения частиц; ε — диэлектрическая проницаемость дисперсионной среды; Е — градиент потенциала внешнего электрического поля; ξ — электрокинетический потенциал; ή— коэффициент вязкости дисперсионной среды.

Уравнение (1) применимо в тех случаях, когда размеры частиц значительно превышают толщину двойного электрического слоя, составляющую доли нанометра. Оно полностью применимо для эритроцитов, лейкоцитов, микроорганизмов и других клеток. Для белковых молекул и коллоидных частиц, размер которых сравним с

200

толщиной двойного электрического слоя, электрофоретическая подвижность зависит от их размера и формы. Для расчетов в уравнение (1) вводят коэффициент, зависящий от размера и формы частиц. Уравнение (1) применяется для вычисления величины электрокинетического потенциала. Для этого необходимо знать напряженность внешнего поля, диэлектрическую проницаемость и коэффициент вязкости среды, а также скорость движения дисперсной фазы.

Обычно применяют два метода электрофореза: макро- и микроэлектрофорез. Один из макрометодов электрофореза заключается в следующем. Исследуемую дисперсную систему помещают на дно У-образной трубки и наливают над ней в боковые колена чистый буферный раствор для того, чтобы электрофорез происходил при постоянном рН. При этом добиваются, чтобы между исследуемой жидкостью и буферным раствором имелась отчетливая граница раздела. Погружают в каждое колено У-образной трубки электроды, соединенные с источником постоянного тока. Создаваемое электрическое поле вызывает перемещение дисперсной фазы исследуемого раствора, и граница между дисперсной системой и буферным раствором перемещается. Перемещение границы регистрируется с помощью длиннофокусной оптики. Если исследуемая смесь содержит несколько компонентов, то каждый компонент движется со скоростью, пропорциональной величине ξ-потенциала. В результате этого смесь разделяется на ряд фракций. При регистрации получается кривая, имеющая ряд пиков, где высота пиков служит количественным показателем данных фракций.

С помощью описанного метода удается выделить и исследовать, например, отдельные фракции белков кровяной плазмы. Данный метод получил особенно широкое распространение после разработки техники этого метода Тизелиусом. Для диагностики многих заболеваний необходимо производить качественный и количественный анализ фракций белков кровяной плазмы. В связи с этим методы электрофореза широко применяются в клинико- лабораторной практике.

В настоящее время более широко применяется менее точный, но более простой метод электрофореза на бумаге, предложенный Виландом и Фишером. На специальную фильтровальную бумагу, смоченную буферным ра-

201

створом, наносят определенное количество исследуемого раствора. Концы этой полоски бумаги соединяют через ванночки, заполненные буфером, с угольными электродами и источником постоянного тока. При включении тока происходит электрофоретическое перемещение компонентов исследуемой смеси. Электрофоретическая подвижность в соответствии с уравнением (1) пропорциональна величине ξ-потенциала отдельных компонентов. После окончания опыта исследуемые вещества в зависимости от величины электрофоретической подвижности и величины взаимодействия с бумагой располагаются на различном расстоянии от линии нанесения — линии старта. Ленту бумаги высушивают и окрашивают красителем, проявляющим исследуемые вещества. В дальнейшем разделенные компоненты подвергают количественному определению путем фотометрирования.

Макрометоды электрофореза применяют в основном для разделения и исследования электрохимических свойств коллоидных растворов. Для изучения электрохимических свойств суспензий различных клеток: эритроцитов, лейкоцитов, бактерий, половых клеток и пр., а также клеточных органоидов — значительно более пригодны микрометоды электрофореза. При этом суспензии клеток в небольшом количестве помещают в специальную камеру, заполненную буферным раствором. В эту камеру вводят также электроды, соединенные с источником постоянного тока. Под действием электрического поля клетки начинают двигаться к противоположно заряженному электроду. Скорость перемещения клеток определяется с помощью микроскопа, снабженного окулярным микрометром.

С помощью методов электрофореза получены важные-данные, характеризующие электрохимические свойства биологических поверхностей. На основе многочисленных экспериментов установлено, что живая прото- плазматическая поверхность всегда заряжена отрицательно, т. е. все биологические поверхности обладают отрицательным электрокинетическим потенциалом. Не известно ни одного примера ясно выраженного положительного потенциала поверхности живого объекта.

Величина ξ-потенциала может иметь различные значения для разных клеток. Большое количество работ посвящено изучению ξ-потенциала эритроцитов. Величина ξ-потенциала эритроцитов у различных млекопитающих.

202

при рН 7,4 колеблется от 7 до 22 мВ. У человека она составляет в данных условиях 16,3 мВ. ξ-Потенциал эритроцитов — очень стабильная величина. В пределах одного вида, например у человека, нет никаких различий в величине ξ-потенциала эритроцитов у представителей различных рас и пола. Они не наблюдаются также между представителями разных групп крови. Электрофоретическая подвижность эритроцитов не изменяется при ряде заболеваний крови, в том числе при многих формах анемий.

ξ-потенциал эритроцитов сохраняет свою величину даже после их полного гемолиза. Можно отметить, что электрохимические свойства поверхности эритроцитов отличаются большой стойкостью и постоянством, ξ-потенциал эритроцитов зависит от рН. Изоэлектрическая точка эритроцитов соответствует рН 1,7, что не совпадает ни с изоэлектрической точкой гемоглобина (рН 6,8), ни с изоэлектрической точкой белков плазмы (рН 4,7). Анализируя приведенные данные и учитывая химический состав оболочек эритроцитов, ученые пришли к выводу, что электрокинетический потенциал эритроцитов обусловлен диссоциацией кислотных групп молекул фосфолипидов (кефалина) на поверхности эритроцитов и не связан с процессами адсорбции белков и ионов. Величина электрокинетического потенциала эритроцитов меняется в том случае, если происходит изменение физико-химического состава самой поверхности клетки. Это наблюдается при некоторых заболеваниях, например гемобластозах, лимфосаркоме.

Для других форменных элементов крови ξ-потенциал изучен значительно слабее, чем для эритроцитов. Лейкоциты при электрофорезе, как и эритроциты, движутся к аноду, но их подвижность примерно в 2 раза ниже подвижности эритроцитов. Электрофоретическая подвижность лейкоцитов весьма близка к подвижности кварцевых частиц, адсорбировавших на своей поверхности молекулы сывороточных белков. Это делает вероятным предположение, что электрокинетический потенциал лейкоцитов обусловлен диссоциацией ионогенных групп белков сыворотки крови, адсорбированных на поверхности лейкоцитов.

По мнению Г. Абрамсона, явление электрофореза наблюдается при миграции лейкоцитов в воспалительные очаги. Хотя лейкоциты обладают активным хемотак-

203

сическим движением, электрокинетические явления могут способствовать миграции лейкоцитов. В воспаленных участках происходят процессы разрушения структур и накопления свободных молекул, главным образом органических кислот, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону (до рН 6,2—6,5). В результате этих физико-химических изменений пограничный участок между воспаленной и невоспаленной тканью приобретает избыточный положительный потенциал величиной до 100 — 150 мВ. А так как лейкоциты обладают отрицательным электрокинетическим потенциалом, то они движутся через стенку капилляра в ткань по направлению к положительно заряженному воспаленному участку.

Большое количество работ посвящено исследованию электрокинетического потенциала бактериальных клеток. Бактериальные клетки обладают отрицательным ξ-потенциалом, который может меняться в очень широких пределах: от нуля до десятков милливольт. Благодаря изучению зависимости ξ-потенциала от рН среды большинство бактерий удалось разделить на две группы. К первой группе принадлежат бактерии, поверхность которых имеет белковую природу. Диссоциация ионогенных групп белковых молекул обусловливает заряд и ξ-потенциал таких клеток, ξ-потенциал этих клеток меняется при изменении рН среды, так как степень диссоциации ионогенных групп зависит от рН. Ко второй группе относятся бактерии, поверхность которых состоит из полисахаридов. Заряд клеток в данном случае обусловлен адсорбцией ионов из дисперсионной среды полисахаридами поверхности. Электрофоретическая подвижность таких клеток практически не зависит от рН среды.

Однако такое деление оказывается довольно условным, так как свойства поверхности бактериальных клеток могут изменяться при изменении внешних условий существования. Так, например, ξ-потенциал золотистога стафилококка при обычных условиях культивирования остается постоянным при большом изменении рН среды.

Если же бактерии культивируются в среде, богатой глюкозой, то наблюдается зависимость ξ-потенциала от величины рН. Это, по мнению многих авторов, следствие накопления на поверхности клеток ионогенных групп белковой природы.

204

Таким образом, метод электрофореза является хорошим средством изучения электрохимических свойств биологических поверхностей: способности к ионизации и способности к адсорбции молекул и ионов.

ЭЛЕКТРООСМОС

Электроосмос — это движение дисперсионной среды в электрическом поле по направлению к электроду, заряженному противоположно дисперсионной среде и одноименно с частицами дисперсной фазы. Для наблюдения электроосмоса удобно, чтобы дисперсная фаза была фиксирована неподвижно. Тогда при наложении электрического поля наблюдается ток жидкости (дисперсионной среды), содержащей противоионы, к противоположно заряженному полюсу. Электроосмотическое движение жидкости может происходить через поры пластинчатых тканей: кожу лягушки, брыжейку млекопитающих, а также через различные капилляры, стенки которых обладают электрическим зарядом, и через осадки мелких частиц, например глины. Впервые электроосмос через осадок частиц глины наблюдал в 1809 г. Рейс c.

205

Если взять сосуд с раствором Рингера и разделить

его кожей лягушки, а в каждую половину опустить электроды, соединенные с источником постоянного тока, то можно получить электроосмотическое движение раствора через поры кожи. Кожа лягушки обладает отрицательным зарядом, дисперсионная среда (раствор Рингера) — положительным. При замыкании цепи раствор движется через поры к отрицательно заряженному электроду (рис. 36, а) и уровень жидкости в одной половине сосуда будет понижаться, а в другой — повышаться.

В настоящее время считают, что электроосмотические явления имеют место при работе секретирующих клеток и органов выделения, в частности почек. В клетках проксимального канальца нефрона функционируют механизмы активного переноса ионов натрия и калия. За счет работы этих механизмов, а также за счет пассивного движения ионов между апикальной и базальной поверхностями клеток канальца возникает разность потенциалов величиной 50 — 60 мВ. Поэтому через стенку проксимального канальца наряду с обычным осмосом возможен и электроосмотический ток жидкости.

ИОНОФОРЕЗ

Ионофорез — это метод введения через неповрежден ную кожу и слизистые оболочки в организм различных лекарственных веществ с помощью постоянного тока. Метод был предложен Ледюком в 1907 г. Из катионов таким путем вводят кальций, цинк, ртуть и другие металлы, а также алкалоиды: хинин, адреналин, новокаин; из анионов — главным образом йод и салицилат. Для введения катионов соответствующим солевым раствором пропитывают анод, покрытый марлей или губкой; при введении анионов действуют катодом. При включении тока происходит движение ионов — ионофорез — через кожу под действием электрического поля.

Кожа человека в обычных условиях обладает очень малой проницаемостью для ионов. Это связано с тем, что поры кожи заполнены воздухом. Крупные органические ионы вообще не могут проникать через кожу. Так как стенки кожных пор обладают электрическим зарядом, то при наложении внешнего электрического поля возникает электроосмотическое движение жидкости через поры

206

либо изнутри, либо снаружи, пропорциональное величине электрокинетического потенциала поверхности поры. Воздух при этом вытесняется из пор и они заполняются жидкостью, в результате чего проницаемость кожи значительно увеличивается. Проникновение ионов через кожу при ионофорезе будет обусловлено двумя процессами: собственно ионофорезом частиц и электроосмосом: жидкости, в которой находятся частицы. Электроосмос по направлению может совпадать, а может быть и противоположным ионофорезу.

Количество введенного при ионофорезе вещества будет зависеть от количества электричества, прошедшего через электроды, и от концентрации вводимого вещества во внешнем растворе. Главное медицинское достоинство ионофореза состоит в возможности строго локализованного, местного действия на ткань.

Имеются данные, что явления ионофореза играют важную роль в поступлении питательных веществ к костным клеткам — остеоцитам. Остеоциты обычно расположены сравнительно далеко от кровеносных сосудов, а каналы, по которым перемещается жидкость в кости, составляют всего 3% ее поперечного среза. Поэтому поступление питательных веществ к остеоцитам путем диффузии было бы затруднительным.

В 1953 г. Ясуда обнаружил, что кость обладает пьезоэлектрическим свойствами — при ее механической деформации возникают электродвижущие силы. Участки кости, которые под действием давления приобретают вогнутую форму, заряжены отрицательно, и наоборот, участки, образующие выпуклую поверхность, заряжены, положительно.

На основе этого Бессет предположил, что меняющий свое направление электрический импульс, возникающий при незначительных физиологических деформациях скелета, служит как бы насосом, обеспечивающим приток к остеоцитам и отток от них ионов и заряженных молекул, в результате чего обеспечивается нормальное питание остеоцитов. Эта гипотеза подтверждается убедительными экспериментами. Так, в бедро собакам имплантировали небольшие, не причиняющие боли батарейки таким образом, что два электрода проникали в костно-мозговую полость. После длительного пропускания небольшого тока было обнаружено, что в области отрицательного электрода усиливался рост кости и про-

207

исходило ее новообразование. Недавно немецкие врачи Фриденберг и Брайтон на основе подобных экспериментов разработали метод заживления костных переломов, который стал применяться в лечебной практике.