Использование интеркалирующих агентов.

Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК [4]. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.

Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых "кривых плавления" (melting curves).

 

22. ДНК-микрочип (англ. DNA microarray) — технология, используемая в молекулярной биологии и медицине. Современный ДНК-микрочип состоит из тысяч дезоксиолигонуклеотидов (зондов, или проб), сгруппированных в виде микроскопических точек и закреплённых на твёрдой подложке. Каждая точка содержит несколькопикомолей ДНК с определённой нуклеотидной последовательностью. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа могут быть короткими участками генов или других функциональных элементов ДНК и используются для гибридизациис кДНК или мРНК (кРНК). Гибридизация зонда и мишени регистрируется и количественно характеризуется при помощи флюоресценции или хемилюминесценции, что позволяет определять относительное количествонуклеиновой кислоты с заданной последовательностью в образце.

В обычном ДНК-микрочипе зонды ковалентно прикрепляются к твёрдой поверхности — стеклянному или кремниевому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina, используют микроскопические шарики вместо больших твёрдых поверхностей.

ДНК-микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости

Printed (spotted) microarrays

"В этих ДНК-чипах пробы были изготовлены с помощью химического синтеза олигонуклеотидов и затем крепится к элементам массива. Пробы наносились иглой в наперед заданные точки подложки или печатались на мелкую сетку подложки принтером, который использовал ту же технологию печати, что и струйный принтер, но вместо капель чернил использовались капли проб нано- или пиколитрового объема."^[4][5]

In-situ synthesized

"Такие микрочипы сделаны с использованием фотолитографии. Процесс выглядит следующим образом: на подложке находятся ковалентные молекулы-линкеры с защитной группой на свободном конце, которая может быть удалена с помощью света. УФ-свет направляется через фотолитографическую маску, снимает защиту и активирует выбранные сайты с гидроксильными группами, которые инициируют сцепление с защищенными нуклеотидами, которые крепятся к активированным сайтам. Маска разработана таким образом, что можно выбрать сайты экспозиции, и, таким образом, определить координаты в массиве, в которых нуклеотид будет прикреплена. Процесс повторяется, применяется новая маска, активизируя различные наборы сайтов и различные основания, позволяющих необходимым ДНК-пробам быть синтезированным на каждом сайте. Каждая проба на чипе требует четыре маски за раунд синтеза: одну маску для синтеза и три другие маски, чтобы предотвратить снятие защиты в том же месте в то время, как добавляются три других три нуклеотида. В среднем, каждая проба длиной в 25 нуклеотидов требует около 100 масок на чип. Такие микрочипы, как правило, используют несколько проб для каждого гена для повышения специфичности и поиска снипов."^[4][5]

High-density bead arrays

«Технология Illumina BeadArray основана на цветокодированных 3-мкм кварцевых бусинах, которые случайным образом распределяются на слайде из кварцевого стекла или субстрате из волоконно-оптических пучков, который собираются в массив. Бусины расположены друг от друга на расстоянии 5.7 мкм и, таким образом, достигается с плотностью упаковки в 40000 элементов массива на квадратный миллиметр. Каждая бусина покрыта сотнями тысяч копий специфической олигонуклеотидной последовательности, с которой гибридизуется анализируемая последовательности. Каждый шарик имеет адрес из 23 олигонуклеотидов и пробу длиной в 50 олигонуклеотидов.

В процессе производства массива бусины случайным образом распределяются по субстрату таким образом, что в каждый массив попадает 50000 бусин. Каждый ген представлен двумя последовательностями проб. Серия декодирующей гибридизации используются, чтобы определить, какие олигонуклеотиды присутствуют в каких координатах для каждого массива.»^[4][5]

Декодирование BeadArray

Стеклянным шарикам в массиве присвоены адреса. Адрес состоит из последовательности флуоресцентно-помеченных олигонуклеотидов, каждый из которых может иметь три значения — 0 (OFF), 1 (ON — FAM), 2 (ON — Cy3). Самыми частыми ошибками являются ошибке перехода одного из состояний ON в состояние OFF, более редкими — состояния OFF в состояние ON. Самыми редкими являются ошибки перехода одного состояния ON в другое, так как они являются сочетанием двух ошибок — неправильного распознавания одного из состояний ON на одном канале и, в то же время, неправильным распознаванием сигнала ON как сигнала OFF. Для проверки корректности используется код, схожий с кодом Хэмминга. Например, для адреса длиной восемь олигонуклеотидов, в расшифрованном адресе должно быть ровно шесть состояний ON и два состояния OFF. Таким образом, существует 1520 корректных и используемых адресов, 272 корректных и не используемых адресов (они используются для распознавания редких двойных ошибок) и 4769 некорректных адресов

 

23. Созданные за рубежом компьютерные информационно-диагностические и справочные системы (LDDD, POSSUM, GENDIAG, JMIM и др.) нашли международное признание как медико-генетические банки большого объема информации, включая врожденные пороки развития и хромосомные синдромы. Использование в России иностранных программных продуктов затруднено как за счет невозможности пополнения приобретенных систем собственными оригинальными данными, так и сложностью использования на практике зарубежных инструкций врачами-практиками. Кроме того, невозможность сертификации иноязычных программ, необходимо учитывать специфику популяций и особенности организации медико-генетической службы Российской Федерации. Эти трудности, по-видимому, можно преодолеть. Так, в Японии знания и разработки европейских и американских исследователей по компьютерным базам данных и системам обобщены и адаптированы для пользователей всей страны в привычном иероглифическом и буквенном начертании. Нашли широкое применение в медико-генетической практике следующие наиболее информативные базы данных: 1) MIM (Mendelian Inheritance in Man. V.A. McKusick). Каталог содержит более 13 500 статей, и база его данных ежедневно пополняется. В каталоге представлены данные о молекулярных дефектах при менделирующих заболеваниях, генетические карты человека, описание всех классов менделирующих нарушений (аутосомно-доминантных, аутосомно-рецессивных, Х- и Y-хромосомных генов), список литературы, предметный указатель. Каждый менделирующий признак имеет шестизначный номер (например, фенилкетонурия-М1М 261600). 2) OMD (Oxford Medical Database - Оксфордская медицинская база данных), которая имеет два подраздела - Лондонскую базу данных (London Dysmorphology Database — LDDB), включающую сведения более чем о 2300 нехромосомных синдромах и Лондонскую нейрогенетическую базу данных (London Neurogenetics Database — LNDB), содержащую сведения более чем о 2200 наследственных заболеваниях центральной и периферической нервной системы. Базы данных основаны на сведениях более чем из 1000 научных журналов и постоянно пополняются. Создание баз данных обусловлено необходимостью диагностики и обеспечения медико-генетического консультирования сотен редких синдромов и болезней, которые сопровождаются тяжелыми нарушениями нервно-психического развития детей

В результате четкого описания симптомов, наблюдающихся у конкретного больного, указанные диагностические системы и базы данных позволяют из всего многообразия заболеваний выделить наиболее сходные синдромы по фенотипическим признакам. Врач получает возможность провести дифференциальную диагностику среди ограниченного перечня нозологии, выбрать оптимальный план дальнейшего обследования и лечения больного или использовать информацию для оценки генетического риска (прогноз заболевания). Имеющиеся компьютерные системы диагностики и базы данных оказываются весьма полезными при проведении медико-генетического консультирования и определения риска возникновения наследственного заболевания, а также могут использоваться в научных и учебных целях. Медицинская генетика как сфера практической деятельности мало формализована и поэтому является трудным полем деятельности для внедрения компьютерных технологий. Продвижение компьютеризации проявилось в использовании графического интерфейса, возможности передать изображение. Создаются видеотеки на компакт-дисках с изображениями больных с разнообразными наследственными синдромами. Открылись новые функциональные возможности в получении информационной справки, цитогенетическим сведениям и клиническим характеристикам, включая фотопортрет больного и микрофотографии хромосом. От внедрения высоких научных технологий можно ожидать громадных достижений в прикладном плане. Мировой опыт в прошлом и настоящем показывает, что достижения генетики человека могут быть реализованы в медицине в наилучшем виде и в полной мере только там, где они используются комплексно в совместной работе генетиков и врачей при соблюдении биоэтических и деонтологических норм. В перспективе именно интеграция баз данных с экспертными системами позволит существенно расширить возможности врачей и повысить эффективность диагностических решений

 

24. ме­тоды позволяют достаточно легко осуществ­лять рекомбинацию in vitro любых фрагментов ДНК. Если один из этих фрагментов в составе гибридных молекул ДНК которая содержит ин­формацию, необходимую для автономной реп­ликации в определенном типе клеток, то другие фрагменты ДНК, ковалентно соединенные с первым, можно амплифицироватъ (размно­жить) в этих клетках. При выделении чистой культуры из колонии (или вирусной бляшки), выросшей из единичной клетки, которая содер­жит индивидуальную молекулу гибридной

ДНК, осуществляется клонирование определен­ного фрагмента ДНК. При этом фрагмент, обес­печивающий репликацию гибридной молекулы ДНК в клетке, называется клонирующим векто­ром. Такой вектор должен обладать следующи­ми основными свойствами:

• иметь ограниченное (предпочтительно од­но) число мест расщепления определенной рестриктазой;

• содержать генетический маркер, который может быть использован для отбора клонов, несущих гибридные ДНК, после введения в чувствительные клетки смеси молекул

• ДНК, полученных в процессе рекомбина­ции in vitro;

• не должен терять репликативные функции при встройке экзогенного фрагмента ДНК. В качестве векторных молекул в генетиче­ской инженерии используют широкий спектр плазмидных и вирусных ДНК. Наиболее попу­лярны клонирующие векторы, несущие несколь­ко генетических маркеров, по которым можно легко отличить исходную векторную ДНК от по­лучаемых гибридов, и имеющие по одному мес­ту действия для нескольких рестриктаз. Кроме того, обычно желательно, чтобы вектор обеспе­чивал эффективную репликацию гибридных ДНК, так как часто важно иметь в клетке по­вышенное число копий клонированных генов.

Частным случаем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы. Это мо­лекулярные векторы, которые наряду с ампли­фикацией обеспечивают правильную и эффек­тивную экспрессию чужеродных генов в клет­ках-реципиентах.

В ряде случаев молекулярные векторы мо­гут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса. Такие молекулы ДНК называют интегративными векторами.

Векторные молекулы играют важнейшую роль на этапе клонирования in vivo изучаемых последовательностей ДНК. Конкретные векторы будут рассмотрены в дальнейшем для каждой генно-инженерной системы отдельно. Использо­вание клонирующих векторов позволяет полу­чать необходимый фрагмент ДНК в индивиду­альном состоянии и в препаративных количест­вах. Это подняло на качественно новый уровень исследования структурно-функциональной ор­ганизации геномов как прокариотических, так и эукариотических организмов (см. 1.7). Разра­ботка и совершенствование экспрессирующих векторов позволяет все с большей определен­ностью создавать штаммы — суперпродуценты чужеродных белков.

 

25. Как клонирующие векторы в генной инженерии используются плазмиды, вирусы и искусственные хромосомы. Самыми первыми векторами стали бактериальные плазмиды - внехромосомные автономно реплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК. Следом для молекулярного клонирования стали использовать вирусы (фаги), которые в природе также могут захватывать и передавать ДНК от клетки к следующей клетке (трансдукция ДНК). Появились различного ряда гибридные векторы, например гибриды фагов с плазмидами - фагмиды (phagemid). Для клонирования больших фрагментов ДНК были сконструированы искусственные хромосомы.. Различные типы клонирующих векторов обладают разным лимитом на размер вставок чужеродной ДНК.

Плазмидные векторы - кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, имеющие клонирующий лимит до ~10 тнп (тысяч пар нуклеотидов). Плазмиды найдены практически у всех исследованных бактерий, у некоторых до ~10 видов разных плазмид, каждая из них выполняет свои характерные функции. Плазмиды также обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей -три типа различных плазмид. Некоторые плазмиды можно рассматривать как молекулярных паразитов, но многие кодируют важные функции, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, способность усваивать определенные вещества. В одной клетке могут сосуществовать только плаз-миды, принадлежащие к разным группам совместимости. Каждая плазмида содержит сайт инициации репликации (ориджин, ori), специфичность которого определяет круг хозяев плазмиды, некоторые могут реплицироваться только в клетках одного вида, другие имеют широкий спектр хозяев. Размеры плазмид варьируют приблизительно от ~1 до 500 тпн. Каждая плазмида имеет постоянную определенную копийность в клетке - количество молекул на клетку. На основе плазмид сконструировано огромное количество различных векторов, поскольку единственным обязательным элементом плазмиды является небольшой сайт инициации репликации, с остальной последовательностью можно проводить любые манипуляции. Схема типичного плазмидного вектора рассмотрена более подробно далее (см. рис. 2.7). Основным недостатком плазмидных векторов является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирование больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селективное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальным временем репликации.

Может и не спросит это

Типичный экспрессионный бактериальный вектор обычно содержит следующие элементы.

1. Сайт инициации репликации (ориджин) – необходимый элемент, то, что делает молекулу ДНК вектором и определяет его хозяйскую специфичность. Структура ориджина репликации обуславливает копийность вектора – количество молекул на клетку(1–4для низкокопийных,15–20для обычных и150–200и более для высокопийных векторов), а также его совместимость с другими векторами. В одной клетке могут сосуществовать только вектора с ориджинами репликации из разных групп совместимости..

2. Селективный ген, предназначенный для отличия содержащих ре-

комбинантную конструкцию клеток (трансформированных) от исходных. Чаще всего используют гены устойчивости к различным антибиотикам, например, популярен ген -βлактамазы,придающий устойчивость к ампициллину.

3. Множественный клонирующий сайт (МКС, MCS), состоящий из близкорасположенных уникальных сайтов нескольких эндонуклеаз рестрикции (единственных в данном векторе) для удобства соединения с клонируемой. Иногда его называют полилинкер. В экспрессионную кассету ген вставляется с сохранением имеющейся рамки считывания или с собственным стартовым кодоном (AUG) на определенном расстоянии от рибосомсвязывающего сайта (RBS).

РГАНИЗМЫ

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАН.

Рис. 2.7. Общая схема типичного бактериального вектора. Экспрессионная кассета изображена в увеличенном масштабе. МКС – множественный клонирующий сайт, RBS (ribosome binding site) или последовательность Шайн-Дальгарно(SD) – сайт связывания рибосом, обеспечивает связывание прокариотической рибосомы за счет комплементарности3'-концевойчасти 16Sрибосомальной рРНК с матричной мРНК

4. Сигнальные и регуляторные элементы экспрессии (транскрипции с последующим синтезом белка), хорошо работающие в клетке-мишени и необходимые для экспрессии клонированного гена. Прокариотические и эукариотические сигнальные и регуляторные элементы сильно различаются, но среди прокариотических, так же как и среди эукариотических, существуют универсальные элементы, хорошо работающие в широком круге хозяев, и специфические, работающие только в конкретной клетке.

Составной частью любого экспрессионного вектора является экспрессионная кассета (рис. 2.7), которая включает все необходимые сигнальные и регуляторные элементы, Для бактерий это промотор, обычно строго регулируемый, регуляторные элементов транскрипции и трансляции (в том числе энхансеры и структуры, стабилизирующие мРНК), сайт связывания рибосом, терминаторы трансляции и транскрипции.

5. Ген-репрессор транскрипции с векторного индуцибельного промотора, часто вводимый в состав векторов для более сильного ингибирования синтеза целевого белка в отсутствие индукции. Особенно это актуально при клонировании токсичных дляклетки-хозяинабелков. Наличие в составе векторагена-репрессоратранскрипции позволяет строже регулировать синтез клонированной ДНК и не зависеть от клеточной регуляторной системы.

6.Дополнительные фрагменты для экспрессии целевого гена в виде фьюжинов. В состав экспрессионной кассеты часто вводят различные эпитопы, при этом целевой белок синтезируется в виде N- илиC-концевогофьюжина (гибридного белка). Цели могут быть различными – повышение уровня экспрессии целевого белка, его стабильности, улучшение его растворимости и сворачиваемости в нативную конформацию и другие, но чаще всего такие эпитопы (таги) вводят для аффинной очистки синтезируемого белка..

7. Редкие кодоны в составе чужеродного гена, приводящие к снижению скорости его трансляции. Только аминокислота триптофан кодируется всего одним кодоном (UGG), остальные аминокислоты, из которых состоят белки, – по крайней мере, двумя, чаще четырьмя,

Для каждого типа организмов существует своя предпочтительная частота использования кодонов (codon usage) и, соответственно.

 

26. Емкость таких фаговых векторов ограничена размерами головки фага и это позволяет клонировать ДНК достаточно большого размера и всегда можно предполагать max. размер такого фрагмента Фаговая частица в которую упаковывается фрагмент ДНК м. б. сконструирована в системе in vivo, in vitro. В составе фаговых векторов м. б. клонированы гены, ответственные за синтез продуктов токсических для клетки. На фаг они не воздействуют.

Первыми были векторы созданные на основе фага λ. Для клонирования с его использованием в геноме выделяют 2 области - существенные и несущественные для внутриклеточного развития фага.

Существенные – обладают связью с репликацией, с образованием белков, с лизисом клетки после внутриклеточного развития фага. Максимальный размер чужеродной ДНК, которая м. б. клонирована в составе фага λ = 22 тыс. пар оснований.

В зрелых вирионах фага Я ДНК находится в виде двухцепочечной линейной молекулы. На концах молекулы ДНК имеются взаимокомплементарные GC-обога- щенные одноцепочечные концы (обозначаются как cosR и cosL). Сразу после попадания в клетку фаговая ДНК цикли зуется по этим концам и функционирует в клет­ке в кольцевой форме. Район ковалентно заши­тых casR и cosh называется cos-caumoM. Фаг Я является умеренным фагом, т. е. в зависимости от условий может развиваться в клетке либо по литическому, либо по лизогенному пути.

При литическом развитии происходит лизис клеток и образуются инфекционные фаговые частицы, при лизогенном молекула ДНК фага Я интегрируется в бактериальную хромосому.

По своей структуре вектор на основе фага λ делятся на:

Векторы внедрения – в единственный сайт рестрикции клонируется чужеродная ДНК, в результате суммарный размер рекомбинантной ДНК превосходит исходный размер векторной молекулы.

Векторы замещения – используются 2 рестриктазы и 1 из фрагментов замещается чужеродной ДНК. В этом случае размер рекомбинантной ДНК незначительно превосходит или равен исходному размеру векторной молекулы.

Преимущества

Во-первых, векторы на основе ДНК фага лямбда обладают значительно большей емкостью, в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 5 до 25 т.п.о.

Во-вторых, фаговые частицы, содержащие упакованную ДНК, способны проходить литический цикл развития внутри бактериальных клеток и, следовательно, образовывать стерильные пятна (бляшки) на газоне бактерий. Такие бляшки содержат в концентрированном виде как сами фаговые частицы с упакованными в них рекомбинантными молекулами ДНК, так и все продукты метаболизма зараженных бактериальных клеток, включая белки и ферменты, которые появляются в результате экспрессии клонированных бактериальных генов.

Разработка упаковочной системы фага λ, т. е. возможность конструирования рекомбинантной ДНК и фаговой частицы in vitro привела к разработке таких векторных молекул – космиды и фазмиды – это векторные молекулы, сочетающие в себе свойства фагов и плазмидных векторов.