Высушить осадок ДНК на воздухе и растворить в 20 мкл буфера ТЕ.

Примечания Содержание общей ДНК в лейкоцитах составляет 30–60 мкг/мл крови.

Соль всегда нужно добавлять к образцу до фенольной депротеинизации, т.к.

экстракция фенолом в низкосолевом буфере может снизить выход ДНК из-за потерь.

В состав многих буферных растворов входит трис-гидрохлорид (Tris–HCl), поскольку трис не допускает развитие микрофлоры в подобном буфере в сравнении с другими буферными системами. Стоковый (от англ. stock – запас) концентрированный раствор кислой соли Tris–HCI с нужным значением pH получают титрованием трисоснования (Tris–OH, трис(гидроксиметил)аминометан) соляной кислотой.

Выделение ДНК из растительных тканей При выделении ДНК из тканей растений важным фактором является эффективное разрушение клеточных стенок. Многие методы, используемые для этого, приводят к сильной фрагментации ДНК (из-за гидродинамических разрывов в цепи!). Часто приходится находить компромисс между размером ДНК и е количественным выходом, ведь молекулы ДНК – самые крупные полимерные биомакромолекулы. Высвобождение высокомолекулярной ДНК из клеток – это только часть задачи, поскольку растительные экстракты содержат большие количества белков, полисахаридов, танинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК.

Ткани растений обычно разрушают механическим растиранием в присутствии детергентов, растворяющих мембраны клеток, и хелатирующих агентов, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счт связывания двухвалентных катионов. От белков ДНП-комплекса избавляются фенольной депротеинизацией образца. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков хроматина предусматривают использование протеиназ. После депротеинизации препарат вс ещ сильно загрязнн полисахаридами.

Если требуется большое количество чистой ДНК, то образцы очищают ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия.

Распространены методы с использованием двух детергентов CTAB (cetyl trimethyl aммonium bromid) и SDS (sodium dodecyl sulfate). Метод с использованием СTAB (Rogers, Bendich, 1985) позволяет получать препараты растительной ДНК с чистотой, достаточной для ПЦР, рестрикционного и гибридизационного анализа. CTAB хорошо растворяет мембраны клеток.

Кроме того, его применение позволяет разделить ДНК и полисахариды, поскольку они отличаются по растворимости в присутствии этого поверхностно-активного вещества. При высоких концентрациях солей нуклеиновые кислоты образуют стабильные, но вместе с тем растворимые комплексы со CTAB. При снижении концентрации соли ниже 0,4М NaCl происходит выпадение в осадок комплексов CTAB/нуклеиновая кислота, тогда как большая часть полисахаридов остается в растворе. Осадок снова растворяют в высокосолевом растворе 1М NaCl и высаживают ДНК спиртом.

Другая методика также предусматривает использование детергентов, в частности SDS, который также осуществляет солюбилизацию биомембран и быструю денатурацию протеинов (при этом инактивируются нуклеазы). Ниже приведена модификация одного из таких методов, изначально разработанного Делапорта с соавт. (Dellaporta et al., 1985). Белки и полисахариды в растительных экстрактах при 0 С образуют комплексы с SDS и выпадают в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе. Высокомолекулярная ДНК, очищенная впоследствии от белков фенолом, осажднная спиртом и растворнная в соответствующих буферах пригодна для рестрикции и ПЦР.

Методика 1. Приготовить навеску 200 мг листьев растений, замороженных заранее при –20 С в морозильнике. Либо быстро заморозить навеску в жидком азоте.

2. Образцы растереть в предварительно охлажднной фарфоровой ступке до гомогенного состояния. Если нет жидкого азота, то при растирании к замороженным листьям необходимо добавить 0,1 г оксида алюминия или прокалнного белого речного песка в качестве абразива. В ступку при этом нужно добавить немного буфера для экстракции ДНК (300 мкл).