Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

В настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE)] является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов. Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля. Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда. Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфа-том натрия [ДСН (SDS)] (C₁₂H₂₅OSO₃Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами. Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики.

Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида. После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков; выделенного из экстракта гомогенного белка; контрольной смеси белков с известными молекулярными массами.

Изменение белкового состава организма. В процессе развития организма белковый состав значительно меняется. В специализированных тканях появляются специфические белки. Например, гемоглобин в эритроцитах, родопсин в клетках сетчатки глаза. Специализированные клетки отличаются и по количеству белков, присутствующих во всех или во многих тканях организма. Белковый состав организма здорового взрослого человека относительно постоянен. Вариации количества отдельных белков могут определяться составом пищи, режимом питания, физиологической активностью.

При различных заболеваниях происходит изменение белкового состава тканей. Эти изменения называют протеинопатиями. Различают наследственные и приобретенные протеинопатии. Пример наследственной протеинопатии – гемоглобинопатии. В зависимости от роли дефектного белка в жизнедеятельности организма наследственные протеинопатии могут вызывать болезни или летальный исход. При наследственных протеинопатиях нарушается первичная структура белка.

Приобретенные протеинопатии развиваются в результате болезни. В этом случае первичная структура белка не нарушается, а происходит

1. количественное изменение белков в пораженном органе или ткани.

2. изменение биологической активности белков из-за нарушения нативной конформации:

– при сдвигах рН среды в щелочную или кислую сторону;

– при присоединении низкомолекулярных веществ к белкам, например, при сахарном диабете к белкам крови присоединяется глюкоза;