Тема II. Методы количественного определения белка

* Количественное определение белка биуретовым методом

1. В соответствии с табл. 1 готовят ряд разведений исходного раствора белка, содержащего 10 мг бычьего сывороточного альбумина в 1мл.

2. В каждую пробирку, содержащую 0,2-1 мг белка в 1мл, а так же к 1 мл исследуемого образца добавить по 4 мл биуретового реактива.

3. Смеси инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут.

4. Регистрируют оптическую плотность проб на спектрофотометре при l 540 (560) нм. В качестве контроля используют раствор, состоящий из 1мл воды и 4 мл биуретового реактива.

5. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

6. Концентрацию белка в исследуемом образце определяют по калибровочному графику.

* Количественное определение белка по методу Лоури

1. Смешивают 50 мл раствора А и 1 мл раствора Б.

2. В соответствии с табл. 2 готовят ряд разведений исходного раствора белка, содержащего 500 мкг бычьего сывороточного альбумина в 1мл. В каждую пробирку, содержащую 25-500 мкг белка в 1 мл, а так же к 1 мл исследуемого образца приливают по 5 мл смеси растворов А и Б.

3. Содержимое пробирок интенсивно встряхивают и инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре.

4. При постоянном перемешивании в пробирки быстро вносят по 0,5 мл реактива Фолина.

5. Пробирки инкубируют в течение 30 минут.

6. Регистрируют оптическую плотность при l=750 нм против контрольной пробы.

7. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

8. Концентрацию белка в исследуемом образце определяют по калибровочному графику.

* Количественное определение белка по методу Брэдфорд

1. В соответствии с табл. 3 готовят ряд разведений исходного раствора белка, содержащего 100 мкг бычьего сывороточного альбумина в 0,1мл. В каждую пробирку, содержащую 10-100 мкг белка в 0,1 мл и к 0,1 мл исследуемого образца приливают по 5 мл реактива Брэдфорд.

2. Пробы инкубируют в течение 5 минут.

3. Регистрируют оптическую плотность при l=595 нм против контроля.

4. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

5. Концентрацию белка в исследуемом образце определяют по калибровочному графику.

Оформление работы

К занятию:

1. Изучить и кратко законспектировать теоретический материал по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать основные этапы работы.

3. Описать полученные результаты по теме I и сделать выводы.

4. Результаты измерений оптической плотности занести в таблицы (см. ниже).

5. Построить калибровочные графики.

6. Расчитать концентрации белка в исследуемых образцах.

7. Описать полученные результаты по теме II и сделать выводы.

Построение калибровочных графиков

Биуретовый метод Таблица 1

№ Концентрация белка, мг/мл Приготовление пробы (объемом 1 мл) Оптическая плотность при l=540 нм

Исходный раствор белка №1, мл Вода, мл

1.

2. 0,2 0,8

3. 0,4 0,6

4. 0,6 0,4

5. 0,8 0,2

6.

Метод Лоури Таблица 2

№ Концентрация белка, 500 мкг/мл Приготовление пробы (объемом 1 мл) Оптическая плотность при l=750 нм

Исходный раствор белка №2, мл Вода, мл

1.

2. 0,05 0,95

3. 0,2 0,8

4. 0,5 0,5

5. 0,8 0,2

6.

Метод Брэдфорд Таблица 3

№	Концентрация белка, 100мкг/0,1мл	Приготовление пробы (объемом 100 мкл)	Оптическая плотность при l=595 нм
Исходный раствор белка №3, мкл	Вода, мкл
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Приложение

Строение и номенклатура аминокислот

В природных объектах обнаружено около 300 аминокислот, однако только 20 из них – протеиногенных – входит в состав белков (см. таблицу в Приложении). В таблице показаны структуры этих аминокислот, а также их трехбуквенные и однобуквенные обозначения, которые широко используют-ся в биохимической литературе. Однобуквенные обозначения применяются для записи наиболее длинных аминокислотных последовательностей (например, полных аминокислотных последовательностей белков).

В настоящее время существует множество различных принципов классификации аминокислот. Рассмотрим некоторые из них.