Методические указания к лабораторному практикуму по курсу

Практикум по

Общей и экологической биохимии

 

Часть I

«Аминокислоты. Белки.

Выделение и количественное

определение белков»

 

 

Минск

МГЭУ

Авторы:

 

зав. кафедрой биохимии и биофизики, канд. биол. наук Бокуть С.Б., преподаватель кафедры биохимии и биофизики Ячник Н.Н.,

доцент кафедры биохимии и биофизики Шейко Л.М.

аспирант кафедры биохимии и биофизики Сяхович В.Э.

 

 

Рекомендовано Советом Международного государственного

экологического университета им. А.Д. Сахарова, № 5 от 21.02.2002г.

 

 

Практикум по общей и экологической биохимии. Часть I: «Аминокис-лоты. Белки. Выделение и количественное определение белков» / Бокуть С.Б. и др. – Мн., 2002 – 55 с.

Практикум содержит учебно-методические материалы для проведения лабораторных работ по курсу "Общая и экологическая биохимия" со студентами 2-го курса. Для каждой лабораторной работы приводятся основы теории по конкретной теме, вопросы для подготовки к занятию, список рекомендуемой литературы, перечень заданий к занятию, описание используемых в лабораторной работе приборов, материалов и реактивов. Включены материалы, описывающие принципы методов качественного и количественного определения аминокислот, пептидов и белков. Приложение содержит информацию о строении и номенклатуре аминокислот.

Все лабораторные занятия написаны авторами настоящего издания совместно.

Соответствует учебной программе курса «Общая и экологическая биохимия» для студентов МГЭУ имени А.Д. Сахарова.

Практикум рекомендуется для студентов ВУЗов, обучающихся по специальностям медико-биологического профиля.

 

Ó С.Б. Бокуть, Н.Н. Ячник, Л.М. Шейко, В.Э. Сяхович, 2002

Ó Международный государственный экологический университет им. А.Д. Сахарова, 2002

Содержание

 

Аминокислоты. Белки. Выделение и количественное определение белков
Лабораторная работа №1 Аминокислоты. Методы обнаружения и идентификации аминокислот. Качественные реакции на аминокислоты, пептиды и белки
Лабораторная работа №2 Простые белки. Физико-химические свойства белков
Лабораторная работа №3 Сложные белки. Методы выделения белков в гомогенном состоянии. Методы количественного определения белка. Определение белка неизвестной концентрации
Приложение Строение и номенклатура аминокислот

 

Методические указания к лабораторному практикуму по курсу

«Общая и экологическая биохимия»

Раздел «Аминокислоты. Пептиды. Белки»

Лабораторная работа № 1

 

Темы:	I. Аминокислоты. Методы обнаружения и идентификации аминокислот
	II. Качественные реакции на аминокислоты, пептиды и белки
Цель работы:	- Ознакомление студентов с наиболее распространенными методами идентификации аминокислот - Освоение методов выявления белков, пептидов и индивиду-альных аминокислот в растворах по качественным реакциям

 

Оборудование и материалы:

· Термостат

· Камера хроматографическая

· Бумага хроматографическая

· Пипетки стеклянные на 1мл и 5 мл

· Микропипетки автоматические

· Цилиндры мерные на 250мл и 100мл

· Колба емкостью 250мл

· Пробирки

· Штативы для пробирок

· Бумага фильтровальная

· Индикаторная бумага универсальная

· Сито нейлоновое

· Ванночка со льдом

 

Реактивы:

· Яичный белок

· Гидроксид натрия (NaOH), 10% раствор, 14.3 М раствор

· Сульфат меди (CuSO₄), 2% раствор, 0.04М раствор

· Ацетат свинца (Pb(CH₃COO)₂), раствор

· Нитрит калия (натрия) (KNO₂, NaNO₂), 0.5% раствор

· Карбонат натрия (Na₂CO₃), 10% раствор

· Нитропруссид натрия (Na₂[Fe(CN)₅NO]), 10% раствор

· Нингидрин, 1% раствор

· Реактив Миллона

· a-нафтол, 0.2% спиртовой раствор

· Сульфониловая кислота, 1% раствор в 5% соляной кислоте

 

· Мочевина, 40% раствор	· b-Аланин, 0.01% раствор
· о -фталевый диальдегид, раствор	· Аргинин
· Желатин, 1% раствор	· Аргинин, 3% раствор, 0.01%
· Фруктоза, 5% раствор	раствор
· Глиоксалевая кислота	· Аспарагиновая кислота
· Формалин, раствор	· Гистидин, 0.01% раствор
· Сахароза, 5% раствор	· Глицин
· Уксусная кислота, ледяная	· Глицин, 0.01% раствор
· Борная кислота, 2.5% раствор	· Глутаминовая кислота
· Азотная кислота (HNO3), конц.	· Метионин, 0.02% раствор
· Серная кислота (H2SO4), конц.	· Пролин, 0.01% раствор
· Соляная кислота (HCl), конц.	· Тирозин
· Фосфорная кислота (H3PO4),	· Триптофан, 0.01% раствор
конц.	· Цистеин, 0.02% раствор
· н-бутанол	· Смесь аминокислот (для хромато-
· Вода дистиллированная	графии)

 

Теоретическая Часть

 

Аминокислоты

 

В процессах жизнедеятельности клетки главенствующую роль играют белки – биополимеры, построенные из мономерных единиц – L-a-аминокислот. Биологические свойства белков определяются, в основном, их аминокислотным составом, точнее порядком расположения аминокислот в полипептидной цепи, что в конечном итоге определяет пространственную структуру белка. Основными функциональными группами аминокислот являются их амино- и карбоксильные группы, которые связаны с одним и тем же (a) углеродным атомом (рис. 1.1).

 

Рис. 1.1 Два варианта изображения структурной формулы аминокислоты.

 

За исключением глицина, у которого R (см. рис. 1.1) представлен атомом водорода, у всех остальных протеиногенных аминокислот четыре группы, связанные с a-углеродным атомом, различны. Благодаря тетраэдрическому расположению четырех разных заместителей у a-углеродного атома, любая аминокислота (кроме глицина) обладает оптической активностью. При этом одни аминокислоты, входящие в состав белков, являются (при рН 7.0) право-вращающими, а другие – лево-вращающими. Тем не менее, вследствие того, что природные аминокислоты имеют пространственную конфигурацию L-глицеральдегида, все они относятся к L-a-аминокислотам.

 

Ионные формы аминокислот

 

Свободные аминокислоты включают, по крайней мере, две слабоионизованные группы: карбоксильную группу (–СОО^¯) и аминогруппу (–NН₃⁺). В растворе эти группы находятся в двух формах, заряженной и незаряженной, между которыми поддерживается протонное равновесие:

R–COOH и R–NH₃⁺ являются протонированными партнерами, то есть кислотами, а R–COO¯ и R–NH₂ – сопряженными основаниями (т.е. акцепторами протонов) соответствующих кислот. Следовательно, структура аминокислоты, изображенная на рис. 1.1, не может существовать в растворе, поскольку одна из указанных групп в той или иной степени ионизирована.

Вполне понятно, что суммарный заряд (алгебраическая сумма всех положительных и отрицательных зарядов) аминокислоты зависит от величины рН, то есть от концентрации протонов в растворе. Значение рН, при котором суммарный заряд аминокислоты равен нулю и она не перемещается в постоянном электрическом поле, называется ее изоэлектрической точкой (рI). Такая в целом незаряженная форма аминокислоты носит название цвиттериона. Для алифатических аминокислот цвиттерион имеет следующий вид:

При увеличении или уменьшении рН по отношению к изоэлектрической точке происходит «перезарядка» аминокислоты и она утрачивает форму цвиттериона. В случае подкисления раствора, степень ионизации карбоксильной группы резко падает и аминокислота выступает в роли основания, присоединяя протоны.

При повышении рН происходит обратный процесс: аминокислота, выступая в качестве кислоты, протоны отдает.