Количественного исследования микроструктур

В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ

(ОБЪЕКТАХ)

Количественная оценка микроструктур является необходимым условием получения объективных данных об их состоянии в норме, при экспериментальных воздействиях и в патологии. Основными количественными показателями микроструктур являются морфо метрические (число структур и их геометрические параметры) и денситометрические, отражающие концентрацию (оптическую плотность) химических веществ в микроструктуpax. Для выявления этих параметров применяют морфометрические и спектрофотометрические методы, а также автоматизированные системы обработки изображений.

Морфометрия

Морфометрия включает совокупность приемов и методов определения геометрических характеристик исследуемых объектов. В качестве объектов могут быть использованы изображения гистологических препаратов (срезов, мазков, отпечатков и др.), а также микрофотографии. Измерение числа структур, их площадей, диаметров, периметров и других показателей производится с помощью специальных сеток (Е. Р. Вейбеля, А. А. Глаголева, С. Б. Стефанова), курвиметра, метода вычисления весовых соотношений путем взвешивания. Измерения микроструктур в световых микроскопах производят с помощью окуляр-микрометра или вышеуказанных сеток, вставляемых в окуляр микроскопа. Морфометрия электронно-микроскопических изображений является разновидностью морфометрии, где измерение геометрических характеристик производят также с помощью сеток непосредственно на экране электронного микроскопа либо на электронных микрофотографиях. Рассмотрим некоторые примеры морфометрических исследований гистологических структур.

1. Измерение микроструктур с помощью окуляр-микрометра. На предметный столик микроскопа устанавливают объект-микрометр. Под микроскопом определяют число делений объект-микрометра, соответствующих числу делений окулярной измерительной линейки (окуляр-микрометра). После чего, пользуясь шкалой окуляр-микрометра, производят измерение объектов.

2. Измерение микроструктур с помощью морфометрических сеток. Морфометрические сетки используются для планиметрических (измерение площадей структур) и стереометрических (определение доли объемов компонентов структур от общего объема) исследований. Например, можно использовать сетку, состоящую из линий постоянной длины, расположенных на равном расстоянии друг от друга таким образом, что получается сетка из равносторонних треугольников. При таком расположении отрезков каждая концевая тестовая точка равнозначна абсолютной величине площади (а)

где Z — длина тестовой линии. Стереометрические исследования можно производить с помощью любой сетки, в которой тестовые точки лежат на равном расстоянии друг от друга, по формуле

где —доля объема, который занимает изучаемый компонент структуры от общего объема; Pi — число тестовых точек, приходящихся на данный компонент; P_t — общее число тестовых точек, приходящихся на всю структуру. При таком исследовании стереометрические данные получаются в относительных цифрах — долях объема в процентах от общего объема.

Микроспектрофотометрия

С помощью этого метода моно определить химический состав, концентрацию и количество различных веществ, содержащихся в конкретных структурах клеток и тканей. При микроспектрофотометрии измеряется количество лучистой энергии, прошедшей через определенный элемент структуры препарата, зависящее от содержания вещества (и его химического состава) в этом элементе. Спектрофотометрирование микрообъектов проводят на приборах — микроспектрофотометрах, представляющих собой комбинацию микроскопа со спектрофотометром, снабженных фотоэлектрическим приемником света. Основными узлами установок для микроспектрофотометрирования являются: 1) источник излучения, 2) монохроматор (обеспечивает получение света необходимой длины волны), 3) микроскоп и приемник лучистой энергии (фотоэлектронный умножитель). Свет от источника (ксеноновая или ртутная лампа высокого давления) направляется через монохроматор, который выделяет излучение нужной длины волны для освещения препарата. Интенсивность излучения в заданной точке препарата регистрируется с помощью фотоэлектронного умножителя. Далее сигнал поступает в автоматический графопостроитель. Для исключения ошибок в измерении необходимо соблюдать стандартность условий: использовать стекла и препараты одинаковой толщины, одинаковую величину регистрирующего зонда и др.

В качестве примера рассмотрим определение содержания ДНКв лимфоцитах крови.

Лимфоциты в мазках крови, окрашенных по Фельгену, микроспектрофотометрируются с использованием излучения с длиной световой волны 570нм. В результате измеряется содержание ДНК в участке ядра лимфоцита, равном по площади размеру регистрирующего зонда. Содержание (m) ДНК во всем ядре лимфоцита определяют по формуле

где с — содержание ДНК в участке, равном по площади размеру зонда; а — площадь зонда; s — площадь ядра лимфоцита.

Размер зонда выбирается, исходя из задачи исследователя и увеличения объектива микроскопа, площадь ядра клетки определяется при помощи окуляр-микрометра.

Автоматизированные системы обработки изображений (АСОИз)

Автоматизация определения количественных параметров (морфометрических и денситометрических) изображений структур, получаемых в световых и электронных микроскопах, позволяет объективизировать их оценку, значительно снизить трудоемкость операций и повысить эффективность исследований.

В состав автоматизированных систем обработки изображений входят специальные сканирующие микроскопы, оснащенные фотометрическим или телевизионным приемником изображения. Видеосигнал, несущий информацию об анализируемом изображении, подается со сканирующего микроскопа в электронную вычислительную машину (ЭВМ).ЭВМ производит математическую обработку изображения и выдает информацию о геометрических, фотометрических, текстурных характеристиках исследуемых объектов. При использовании достаточно мощных ЭВМ и специальных программ с помощью АСОИз можно автоматически распознавать и классифицировать исследуемые объекты и структуры, осуществлять их трехмерную реконструкцию, а при необходимости математически моделировать изображения структур при различных воздействиях или патологии.

Рассмотрим схему автоматизированного анализа изображений клетки крови. Он состоит из следующих этапов: 1) сканирование клетки для получения цифровой матрицы ее изображения, 2) ввод цифрового изображения в ЭВМ, 3) обработка на ЭВМ цифрового изображения с целью нахождения количественных характеристик объекта, 4) выдача результатов на печать или дисплей.

Цель занятия — изучение принципов получения количественных характеристик микроструктур с помощью морфометрических и спектрофотометрических методов.

Задачи:

1. Овладение морфометрическими методами изучения структур гистологических препаратов.

2. Овладение морфометрическими методами изучения ультраструктур на электронных микрофотографиях.

3. Ознакомление с методами микроспектрофометрии и получения денситометрических характеристик — концентрации и содержания веществ в клетках.

4. Ознакомление с автоматизированными системами обработки изображений клеток и тканей.

Задания:

1. С помощью окулярной сетки (или окуляр-микрометра) произвести измерение диаметра и площади клетки, ее ядра и вычислить ядерно-плазматическое отношение.

2. На электронной микрофотографии с помощью сетки определить количество и основные морфометрические параметры митохондрий, гетеро- и эухроматина.

3. На основании показателей микроспектрофотометра и морфометрических параметров определить содержание ДНК или РНК в клетке.

4. Определить гистохимический показатель активности ферментов в лейкоцитах крови (по Астальди и Верга).

5. Ознакомиться с устройством и работой автоматизированной системы обработки изображений «Протва-М 11» и др.

Контрольные вопросы:

1. Какие параметры клеток можно определять с помощью метода морфометрии?

2. Каков принцип работы с морфометрической сеткой?

3. В чем состоит принцип микроспектрофотометрии и какие характеристики клеток можно изучать на микроспектрофотометре?

4. Из каких основных частей состоят автоматизированные системы обработки изображений и какие параметры клеток на них можно исследовать?

Л ИТЕРАТУРА

Основная

Гистология / Под ред. Афанасьева Ю. И., Юриной Н. А. М.: Медицина, 1989, с. 15-21.

Дополнительная

Агроскин Л. С, Папаян Г. В. Цитофотометрия. — Л.: Наука, 1977.

Волкова О. В., Елецкий Ю. К. Основы гистологии с гистологической техникой.— М.: Медицина, 1982.

Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия. Будапешт, 1962, с. 17-147.

Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники. Л.: Медицина, 1969, с. 7-113.

Оптико-структурный машинный анализ в биологии и медицине. — М.: изд. УДН, 1984.

Основы общей гистологии и гистологическая техника / Под ред. проф. В. Г. Елисеева. — М.: Медицина, 1967.

Пирс Э. Гистохимия.— Пер. с англ.—М.: Изд-во иностр. лит., 1962.

Ромейс Б. Микроскопическая техника.— Пер. с нем. — М.: Изд-во иностр. лит., 1954.

Ташкэ К. Введение в количественную цитогистологическую морфометрию.— Бухарест: Изд-во АН СРР, 1980.

Тема

ЦИТОЛОГИЯ

Цитология — наука о клетке, об общих закономерностях, присущих клеточному уровню организации живой материи. Клетка (cellula) — наименьшая структурная единица живого, она является основой развития, строения и жизнедеятельности всех животных и растительных организмов.

Несмотря на большое многообразие, все клетки имеют ряд общих структурных признаков. Клеточная теория формулирует это положение как гомологичность, т. е. принципиальное сходство строения клеток всех животных и растительных организмов. Так, для клеток характерно наличие цитоплазмы (cytoplasma) и ядра (nucleus). Цитоплазма включает в себя гиалоплазму (hyaline — прозрачный), или матрикс цитоплазмы; органеллы (organellae cytoplasmicae), представляющие собой постоянные образования, имеющие характерную структуру и специфическую функцию в клетке, и включения (inclusiones) — временные образования, являющиеся продуктом деятельности клетки. Цитоплазма отделена от окружающей клетку среды и от соседних клеток плазмолеммой — внешней клеточной мембраной (plasmolemma). Ядро имеет ядерную оболочку, хроматин, ядрышко и нуклеоплазму (рис. 1).

Рис. 1. Схема ультрамикроскопического строения клетки

животных организмов:

1 — ядро клетки; 2 — плазмолемма; 3 — микроворсинки; 4 — аграну-лярная эндоплазматическая сеть; 5 —гранулярная эндоплазматическая сеть; 6 — комплекс Гольджи; 7 — центриоль и микротрубочки центросферы; 8 — митохондрии; 9 — эндоцитозные вакуоли; 10— лизосомы; 11 — микрофиламенты; 12 — рибосомы; 13 — выделение гранул секрета (Гистология / Под ред. В. Г. Елисеева, Ю. И. Афанасьева, Н. А. Юриной, 1983).

Кроме клеток в организме встречаются неклеточные структуры: симпласты, синцитии и межклеточное вещество, которые являются производными клеток и также изучаются в курсе цитологии.

Подтема 1

ОБЩАЯ МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК

И НЕКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР.