Для электронной микроскопии

 

1. Быстрое взятие кусочков размером 0,5-1,0 мм³.

2. Фиксация в 3,5% буферном растворе глютаральдегида — 1 ч.

3. Промывание в буферных растворах (рН 7,3-7,4) — 3 раза по 5 мин.

4. Фиксация (постфиксация) в растворах, содержащих четырехокись осмия — 1-2 ч.

5. Промывание в буферных растворах — 3 раза по 5 мин.

6. Обезвоживание в спиртах восходящей концентрации — 50°, 60°, 70°, 90°, 100° (по 15 мин в каждом).

7. Пропитывание эпоксидными смолами — 24 ч.

8. Заливка эпоксидными смолами (эпон, аралдит) с добавлением катализатора, ускоряющего полимеризацию смол, и помещение в термостат с температурой 58° — 2 сут.

9. Приготовление полутонких срезов толщиной 1-2мкм и окраска их метиленовым синим.

10. Приготовление ультратонких срезов толщиной 400-800 нм, перенесение их на сеточки.

11. Окрашивание (контрастирование) ультратонких срезов на сеточках уранилацетатом (10 мин), а затем цитратом свинца (10 мин).

Цель занятия — ознакомление с принципами гистологических и гистохимических методов.

Задачи:

1. Овладеть основными методиками приготовления фиксированных и окрашенных препаратов клеток, тканей и ор­ганов для световой микроскопии и работой на микротоме.

2. Овладеть некоторыми цито- и гистохимическими методами исследования.

3. Ознакомиться с методами прижизненного изучения клеток и тканей.

Необходимый исходный уровень знаний:

1. Понятие о видах гистологических препаратов.

2. Требования к гистологическому препарату для микроско-пирования в световых и электронных микроскопах.

3. Понятие о цито- и гистохимических методах исследования.

 

Задания:

1. Залить в парафин материал, проведенный ранее, до второго парафина (схема 1).

2. Изучить конструкцию санного микротома и овладеть методами приготовления парафиновых срезов и получения замороженных срезов в криостате.

3. Пользуясь сведениями, приведенными в схеме 2, окрасить парафиновый срез гематоксилин-эозином. Обратить внимание на то, что гематоксилин (основной краситель), окрашивает ядра в фиолетовый цвет, а эозин (кислый краситель) — цитоплазму клеток в розовый цвет.

4. Пользуясь указаниями схем 4 и 5, окрасить срезы акридином оранжевым и метиловым зеленым-пиронином.

5. Приготовить препарат свежей крови и исследовать в фазово-контрастном микроскопе.

6. Овладеть методом суправитального окрашивания мазков крови с помощью красителя бриллианткрезилового синего, позволяющим выявлять ретикулоциты (молодые эритроциты). Обратить внимание на окрашивание структуры ретикулоцитов в синий цвет.

7. Ознакомиться с методиками приготовления гистологического материала для электронной микроскопии.

Контрольные вопросы:

1. Какие виды гистологических препаратов вы знаете?

2. Каковы основные этапы приготовления гистологических срезов?

3. В чем заключается сущность фиксации тканей и органов? Какие бывают фиксаторы и каков механизм их действия?

4. Для чего используют заливку в твердые среды (парафин и др.) гистологических объектов?

5. С какой целью применяют замораживание кусочков органов?

6. С какой целью применяют окрашивание препаратов? Какие основные группы красителей используют в гистологических исследованиях? Почему структуры называют оксифильными или базофильными?

7. Для чего производят «заключение» препарата, какие среды для этого применяют?

8. Какие методы называют гистохимическими, в чем их сущность?

9. Назовите методы прижизненного исследования клеток и тканей.

10. В чем состоят особенности приготовления препаратов для электронной микроскопии?

Ситуационные задачи:

 

1. Врач должен срочно получить ответ о состоянии органа. Каким методом можно быстро приготовить гистологический срез?

2. Необходимо выявить наличие жира в клетках. Какой фиксатор вы рекомендуете использовать?

3. Вами получен материал, фиксированный спиртовым фик­сатором. Какие этапы обработки можно исключить?

4. При исследовании клеток в люминесцентном микроскопе после окрашивания акридиновым оранжевым вы обнаружили зеленое и красное свечение структур. Каков их химический состав?

Подтема 2

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

 

Основными методами исследования гистологических объектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в клинической и экспериментальной практике.