И регуляция гликогенфосфорилазы

Гликогенолиз – процесс анаэробного распада гликогена. Вовлечение D-глюкозных единиц гликогена в процесс гликолиза происходит при участии двух ферментов: фосфорилазы а и фосфоглюкомутазы. Образовавшийся в результате фосфоглюкомутазной реакции глюкозо-6-фосфат может включаться в процесс гликолиза. После образования глюкозо-6-фосфата дальнейшие пути гликолиза и гликогенолиза полностью совпадают:

 

 

В процессе гликогенолиза в виде макроэргических соединений накапливаются не две, а три молекулы ATP (ATP не тратится на образование глюкозо-6-фосфата). Кажется, что энергетическая эффективность гликогенолиза выглядит несколько более высокой по сравнению с процессом гликолиза, но эта эффективность реализуется только при наличии активной фосфорилазы а. Следует иметь в виду, что в процессе активации фосфорилазы b расходуется ATP.

Гликоген-фосфорилаза катализирует последовательное удаление гликозильных остатков с невосстанавливающего конца молекулы гликогена. Ортофосфат расщепляет гликозидную связь между С₁ концевого остатка и С₄ соседнего остатка. Он специфически разрывает связь между углеродным атомом С₁ и гликозидным атомом кислорода с сохранением α-конфигурации при С₁.

Реакция, катализируемая фосфорилазой, in vitro легко обратима. При рН 6,8 равновесное отношение ортофосфата к глюкозо-1-фосфату равно 3,6. Δ G ⁰ для этой реакции мало, потому что гликозидная связь замещается фосфоэфирной, которая имеет почти такой же потенциал переноса. Однако in vivo фосфоролиз сдвинут далеко в сторону распада гликогена, поскольку отношение [Р_i]/[Глюкозо-1-фосфат] обычно превышает 100.

Фосфорилаза скелетных мышц существует в двух взаимопревращающихся формах: активная фосфорилаза а и обычно неактивная фосфорилаза b (рис. 17.3).

 

 

Фосфорилаза b Фосфорилаза b Фосфорилаза a Фосфорилаза a

(активная (неактивная (неактивная (активная

R-форма) Т-форма) Т-форма) R-форма)

 

Рис. 17.3. Регуляции гликоген-фосфорилазы в скелетных мышцах

 

Фермент может принимать каталитически неактивную Т (напряженную) конформацию или активную R (релаксированную) конформацию. Равновесие R↔T для фосфорилазы а сдвинуто далеко в сторону активного R-coстояния. В противоположность этому фосфорилаза b находится преимущественно в неактивном Т-состоянии, исключая случаи, когда содержание AMP находится на высоком уровне, а содержание АТР и глюкозо-6-фосфата – на низком. При большинстве физиологических состояний доля активного фермента определяется скоростями фосфорилирования и дефосфорилирования. Фермент представляет собою димер, молекулярная масса субъединиц которого равна 92 кДа. Фосфорилаза b превращается в фосфорилазу а путем фосфорилирования одного остатка серина (Ser-14) в каждой субъединице. Эта ковалентная модификация катализируется специфическим ферментом киназой фосфорилазы, которая была открыта Эдмондом Фишером и Эдвином Кребсом. Фосфорилаза а инактивируется специфической фосфатазой, гидролизующей фосфорильную группу, присоединенную к Ser-14.

Мышечная фосфорилаза b активна только в присутствии высоких концентраций AMP, действующих аллостерически. AMP связывается с центром связывания нуклеотида и изменяет конформацию фосфорилазы b. ATP действует как отрицательный аллостерический эффектор, конкурируя с AMP. Глюкозо-6-фосфат также ингибирует фосфорилазу b преимущественно путем связывания с другим активным центром. При большинстве физиологических состояний фосфорилаза b неактивна вследствие ингибирующего действия АТР и глюкозо-6-фосфата. В противоположность этому фосфорилаза а полностью активна независимо от содержания AMP, ATP и глюкозо-6-фосфата. Доля активного фермента определяется, прежде всего, скоростями фосфорилирования и дефосфорилирования. В неработающей мышце почти весь фермент находится в неактивной b -форме. Повышенное содержание адреналина и электростимуляция мышцы приводят к образованию активной a -формы.

Рентгенокристаллографические исследования а- и b -форм гликоген-фосфорилазы значительно упростили изучение каталитических и регуляторных механизмов этого ключевого фермента метаболизма. Так, 841 аминокислотных остатков мономерной субъединицы компактно упакованы в три структурных домена (рис. 17.4): аминоконцевой домен (310 остатков), гликоген-связывающии домен (160 остатков) и карбоксиконцевой домен (371 остаток).

Каталитический центр локализован в глубокой щели, образованной остатками аминокислот каждого из этих трех доменов. Такая защита активного центра от водной среды должна, очевидно, благоприятствовать преобладанию фосфоролиза над гидролизом. Пиридоксальфосфат (витамин В₆), который необходим для действия фермента, связывается вблизи участка присоединения глюкозо-1-фосфата. Альдегидная группа этого кофактора образует шиффово основание с лизиновой боковой цепью С-концевого домена. Сохранение ферментативной активности после восстановления шиффова основания боргидридом говорит о том, что в данном случае альдегидная группа в отличие от случаев с другими других пиридоксалевыми ферментами не участвует в катализе. В то же время фосфорильная группа пиридоксальфосфата, по-видимому, принимает прямое участие в катализе.

В молекуле фосфорилазы имеется также участок связывания гликогена, отстоящий от каталитического центра на 30 А. Этот участок имеет важное значение для присоединения фермента к частице гликогена. Благодаря такому большому расстоянию между местом связывания гликогена и каталитическим центром фермент может осуществлять фосфоролиз многих концевых остатков, не претерпевая диссоциации и реассоциации после каждого каталитического цикла.

 

Рис. 17.4. α-углеродный остов фосфорилазы а

 

Помимо этого фосфорилаза содержит по меньшей мере два аллостерических участка контроля. Глюкоза и нуклеозиды, являющиеся аллостерическими ингибиторами печеночной фосфорилазы а, связываются вблизи каталитического центра. AMP, аллостерический активатор фосфорилазы b, связывается рядом с границей между субъединицами, далеко от каталитического центра и участка связывания гликогена.

Серин-14, место фосфорилирования при превращении фосфорилазы b в фосфорилазу а, также локализован вблизи границы между субъединицами. Эта фосфорильная группа в фосфорилазе а соединена водородной связью с боковой цепью аргинина-69. В то же время область, охватывающая 19 N-концевых остатков в фосфорилазе b, не имеет строго определенной структуры. Эта область b -формы по гибкости напоминает очень подвижный активационный домен в трипсиногене, который принимает строго упорядоченную конформацию при превращении в трипсин.

Активность киназы гликоген-фосфорилазы также регулируется путем ковалентной модификации. Она подобно фосфорилазе, в результате фосфорилирования превращается из формы с низкой активностью в высокоактивную форму. Фермент, катализирующий эту активацию, является компонентом системы гормон-циклический AMP.

Киназа фосфорилазы может быть частично активирована и другим путем (под действием Са²⁺ в концентрациях порядка 10^{-7 М}). Этот механизм активации имеет для биологических процессов важное значение, поскольку мышечное сокращение запускается высвобождением Са²⁺. Таким образом, расщепление гликогена и мышечное сокращение связаны преходящим увеличением содержания Са²⁺ в цитоплазме.

Рассмотрим связь между гормонами, влияющими на обмен гликогена, и реакциями фосфорилирования, определяющими активности гликоген-синтазы и гликогенфосфорилазы. При этом последовательность реакций следующая:

1) адреналин связывается с плазматической мембраной мышечной клетки и стимулирует аденилатциклазу;

2) аденилатциклаза катализирует образование циклического AMP из АТР;

3) повышенное внутриклеточное содержание циклического AMP активирует протеинкиназу. В отсутствие циклического AMP эта киназа неактивна, связывание циклического AMP приводит к ее аллостерической стимуляции;

4) зависимая от циклического AMP протеинкиназа фосфорилирует киназу фосфорилазы и гликогенсинтазу. Фосфорилирование обоих ферментов лежит в основе координированной регуляции синтеза и расщепления гликогена. Оно приводит к «включению» фосфорилазы (при посредстве киназы фосфорилазы) и к одновременному «выключению» гликогенсинтазы (прямым путем).

Изменения ферментативной активности, вызываемые фосфорилированием, могут быть обращены путем гидролитического удаления фосфорильной группы. Например, превращение фосфорилазы а в фосфорилазу b катализируется фосфатазой фосфорилазы:

+ Н₂О ® + Р i

 

 

Ser-O-PO₃^2- Ser-OH

 

Данный фермент гидролизует также фосфорильную группу активной формы киназы фосфорилазы, вызывая ее инактивацию. Кроме того, эта же фосфатаза удаляет фосфорильиую группу из гликоген-синтазы в, превращая ее в значительно более активную а -форму. Таково еще одно молекулярное устройство, обеспечивающее координированный синтез и расщепление гликогена. Активность фосфатаз также, по-видимому, регулируется. Например, сочетание Са²⁺ и Mg-ATP ингибирует фосфатазу фосфорилазы, но активирует киназу фосфорилазы. Фосфатаза гликоген-синтазы в мышцах и игибируется гликогеном. Поэтому при высоком содержании гликогена мышечная гликоген-синтаза будет оставаться в фосфорилированной в -форме.

Сигнал, возникающий при образовании циклического AMP, также может быть «выключен». Фосфодиэфирная связь в циклическом AMP гидролизуется специфической фосфодиэстеразой с образованием AMP, который не активирует протеинкиназу. Значение AG⁰ этой высокоэнергетической реакции составляет ‒ 11,9 ккал/моль.

Каскад ферментативных реакций в регуляции обмена гликогена аналогичен каскаду протеолитических реакций при свертывании крови. В обоих случаях ферментативный каскад создает высокую степень амплификации. В случае распада гликогена имеются три ферментативные стадии контроля, тогда как при синтезе гликогена таких стадий две. Если бы имела место прямая регуляция гликоген-фосфорилазы и гликоген-синтазы путем связывания адреналина, количество гормона, необходимое для усиления распада гликогена, было бы более чем в тысячу раз выше того количества, которое требуется в присутствии амплифицирующего каскада.