Методы индикации вирусов при культивировании их в организме лабораторных животных

Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА).

26)что такое цпд? Виды цпд?

ЦПД - (цитопатическое действие вирусов) - деструктивные изменения отдельных клеток и клеточного монослоя, возникающие в результате продуктивной вирусной инфекции клеток и цитотоксического действия вирионов. В клеточном монослое ЦПД проявляется в форме сплошной или очаговой круглой или полиморфноклеточной дегенерации, образовании многоядерных клеток или клеточных симпластов, а также в пролиферативном разрастании клеток. В пораженных вирусом клетках ЦПД проявляется в пикнозе ядра, маргинации и зернистости хроматина, появлении включений, телец, кристаллов; в цитоплазме появляются вакуоли, наступает ее сморщивание и дегенерация. ЦПД используют для индикации и идентификации вирусов.

Виды: 1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток

(полиовирусы, вирусы Коксаки).

2. Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток

(вирус гриппа).

З. Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).

4. Крупнозернистая равномерная деструкция клеток

(вирус герпеса).

5. симластообразование (вирус кори).

Механизм РГА и РГАдс

на поверхности эритроцитов имеются рецепторы мукопротеидной природы, способные адсорбировать вирионЫ, а на поверхности гемагглютинирующих вирусов располагаются гемагтлютинины - сложные белковые тела с энзиматической активностью. При смешивании эритроцитов с вирусосодержащей жидкостью гемагтлютинины вируса при помощи фермента муциназы вступают во взаимодействие с рецепторами эритроцитов, в результате чего происходит адсорбция вирусов на эритроцитах. Вирионы, адсорбированные на одном эритроците, способны свободными поверхностями соединяться с другими эритроцитами, образуя при этом мостики между ними, что и приводит к склеиванию (агглютинации) эритроцитов.
Адсорбция вирусов на эритроцитах является энзимэтическим процессом

ЦВЕТНАЯ РЕАКЦИЯ МЕХАНИЗМЫ

При репродукции в ткани вирусов клетки гибнут и цвет среды не меняется. Добавление специфической сыворотки нейтрализует вирус, гибель клетки не происходит и индикатор (феноловый красный) в кислой среде меняет свой цвет с малинового на желтый. При росте клеток, не пораженных вирусом, происходит накопление кислых продуктов метаболизма что приводит к изменению рн среды и цвета индикатора

29)Метод бляшек механизм. В основе метода лежит образование в местах цитопатогенного действия вируса обесцвеченных пятен, так как пораженные клетки теряют способность сохранять или воспринимать витальные окрашивания. Пятна, или бляшки, представляют собой изолированные колонии вируса в однослойных культурах, видимые микроскопиически в виде неокрашенных округлых форм, четко выделяющиеся на фоне живых клеток, окрашенных в красный цвет.

30. Бактериофаги - бактериальные вирусы, вызывающие разрушение (лизис) бактерий и других микроорганизмов. Бактериофаги размножаются в клетках, лизируют их и переходят в др., как правило, молодые, растущие клетки. Бактериофаги состоят из головки округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45-140 нм и отростка толщиной 10-40 и длиной 100-200 нм (рис.). Другие Бактериофаги не имеют отростка; одни из них округлы, другие - нитевидны, размером 8х800 нм. Содержимое головки состоит преимущественно из РНК и небольшого количества белка. Отросток имеет вид полой трубки, окруженной чехлом, содержащим сократительные белки, подобные мышечным. У ряда Бактериофагов чехол способен сокращаться, обнажая часть стержня. На конце отростка у многих Бактериофаги имеется базальная пластинка с несколькими шиловидными или другие формы выступами. От пластинки отходят тонкие длинные нити, которые способствуют прикреплению фага к бактерии. Оболочки головки и отростка состоят из белков. Каждый Бактериофаг обладает специфическими антигенными свойствами, отличными от антигенов бактерии-хозяина и других фагов. Имеются антигены, общие для ряда фагов (особенно содержащих РНК). Некоторые фаги применяли для профилактики и лечения ряда бактериальных инфекционных болезней человека (дизентерия, брюшной тиф, холера, чума, стафилококковые и анаэробная инфекции и др.) и животных. Однако антибиотики и другие химиотерапевтические средства оказались эффективнее фагов, в связи с чем применение их с лечебной целью сузилось. Бактериофаги успешно применяются при определении вида бактерий, актиномицетов. Бактериофаги могут вредить производству антибиотиков, аминокислот, молочных продуктов, бактериальных удобрений и в других отраслях микробиологического синтеза.

31.Прионы - это белковые инфекционные частицы, имеющие вид фибрилл размером 10-20 х 200 нм, они вызывают у животных и человека энцефалопатии в условиях медленной вирусной инфекции. Вироиды - это небольшие молекулы кольцевой, суперспирализованной РНК, не содержащие белка и вызывающие заболевание растений.Прионные болезни — это группа заболеваний человека и животных, при которых происходит гибель нервных клеток головного мозга за счет накопления патологического белка (приона). Прионный белок существует в головном мозге и в норме, но при патологии он становится способным к формированию больших белковых агрегатов, мешающих работе нервной клетки. Белковые комплексы сначала накапливаются внутри клетки, а потом высвобождаются во внеклеточное пространство, где формируют «амилоидные бляшки».

32.Контаминация — попадание загрязнителей в образец или культуру;засорение (загрязнение) чистой культуры посторонними микроорганизмами. Деконтаминация—процесс уничтожения микробов в (на) каких-либо объектах. Д. осуществляют дезинфекцией или стерилизацией.Дезинфекция — комплекс мер по уничтожению патогенных микробов и резкое снижение общей микробной обсемененности материала или объекта. Стерилизация — обеспложивание, объектов, при кт уничтожаются все формы микроорганизмов. Асептика - совокупность мер, направленных на предупреждение попадания микробов в организм. Антисептика - комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию инфекционного воспалительного процесса.

33. Деконтаминация —процесс уничтожения микробов в (на) каких-либо объектах. Д. осуществляют дезинфекцией или стерилизацией. Цель в медицине – отрыв путей передачи, опосредованных мед.оборудованием или действиями врача, и снижение риска передачи инфекционных заболеваний.Воздействие на клеточные стенки гр+ бактерий и грибов должно состоять в разрушении оболочки из пептидогликана или хитина, так же в учете наличия в кл.стенкетейхоевых кислот. Разрушение пойдет по пептидным связям, по кислородным мостикам между гликозидными кольцами. Оболочка споры из денатурированного белка, следовательно мало нарушить структуру белка, надо разрушить вторичну структуру белка, по ковалентным связям: окислять амикислотные остатки или разрывать пептидные связи. У гр- над пептидогликановой оболочкой есть еще внешняя мембрана, где ЛПС, липопротеины и белки-порины. Необходимо определить мин.плотность необходимых нарушений хим.связей для нарушения целостности, стабильности и связаностикл.стенок. У вирусо надо не только разрушить белковую оболочку, но и уничтожить наследственную информацию. У вироидов белковой оболочки нет, только наслед.материал. Для уничтожения приона необходимо разрушить все молекулы, образующие его.

34. Физические факторы деконтаминации: температура, высушивание, фильтрование, лучистая энергия (уф и ионизирующее излучение), ультразвук, ионизированная плазма. Хим. Факторы: атибиотики, антисептики, дезинфектанты, консерванты, фенолы, галогены, спирты, ПАВ, соли тяж.металлов, красители, окислители, кислоты и щелочи, альдегиды.

35. Методы дезинфекции:

Механический, физический метод заключается в высокотемпературной обработке.Химический, биологический метод основан на использовании антагонизма различных видов микроорганизмов. Так, при использовании бактериофагов, то есть вирусов бактерий, уничтожаются стафилококки, синегнойная палочка, брюшнотифозные бактерии и т. д. Методы стерилизации: тепловая (прокаливание.Сухой жар, под давлением, текучий пар), газовая, химическая (перекись водорода, хлоргексидин, формальдегид, спирт), ультразвуком, уф и гамма-излучением, плазмой.

36.Предстерилизационная очистка предусматривает окончательное удаление остатков белковых, жировых, механических загрязнений и остаточных количеств лекарственных препаратов.Предстерилизационной очистке должны подвергаться все изделия, подлежащие стерилизации.Этапы предстерилизационной очистки: 1: промывание проточной водой после дезинфекции над раковиной в течение 30 секунд до полного уничтожения запаха дезсредств; 2: замачивание в моющем растворе при температуре воды 50°С на 15 минут шприцев и головок в разобранном состоянии; 3: мытье каждого изделия в этом же растворе, где проводилось замачивание, с помощью ерша в течение 30 секунд;4: споласкивание проточной водой; 5: споласкивание дистиллированной водой в течение 30 секунд;6: просушивание горячим воздухом при температуре +75..+87 в сушильных шкафах. Контроль качества методы: визуальный, бактериологический, химический, йодно-крахмальный. В материале после дез. И стерилиз. Должен быть хлор.

37. Автоклав: 1 атм 45 мин 120⁰, 2 атм 20 мин 132⁰. Газовый аппарат 30 мин. Р-ры хим. в-в. Ультразвук с моющим средством 15 мин. УФ и гамма-излучение 1 час. Плазмой 10-15 мин.

№38Современные методы стерилизации.контроль стерилизации. Физические методы: высокая тем.,ионизируещее излучение, фильтрование., глас- перленовый стерилизатор при тем=250гр.Комбенированные методы стерилизации:-газовая –изделия стерил от 4- 16 ч.контроль процесса ведут приборы.Плазменная стерилизация- 10 -15 мин, в зависимости от загрязнений.обьем камеры 1 л. Контроль: по показанию приборов.,с использованием физико – хим тестов.,биологические тесты, молекулярно-генетический метод контроля.(анаэробные, вирусы)

№ 39.правила техники безопасности при раб. С биоматериалом инф.ВИЧ. – заклеять открытые раны лейкопластырем.- использовать латексные перчатки однаразовые Во время работы перчатки обрабатывать 70% спиртом или другими дезинфектантами,
- мыть руки с мылом немедленно после контакта с кровью или биологическими жидкостями организма; - защищать лицо – марлевой повязкой, глаза – очками или щитком.
- обрабатывать поверхность рабочих столов, загрязненных кровью, немедленно 3% раствором хлорамина или 6% раствором перекиси водорода с 0,5% раствором моющего средства дважды с интервалом в 15 минут;
- запрещать пипетирование ртом. Засасывание в капилляры производить только с помощью резиновых груш;
- шприцы, иглы и катетеры сразу после использования помещают в специальный контейнер для дезинфекции и утилизации; - иметь на рабочем месте аптечки и достаточное количество дезинфицирующих средств.

№40. Микробный антагонизм- при котором один вид микробов угнетает развитие других, довольно широко распространен в природе.это -отношения между микроорганизмами выработались на протяжении длительного периода эволюции в борьбе за существование.

Хим факторы: Антибиотики- вещ-ва. Блокирующие ферментативный процесс в клетке,или разрушает основные ее структуры. Гликопротеиновой или протеиновая структура..Бактериоцины- в-ва, белковой природы,короткие пептидные цепочки, без ферментативной активности., действуя через специф. или неспециф. Клеточные рецепторы. Токсические продукты метаболизма- ислоты, эфиры, амины, сероводород, перекись. Формирование биопленки.

№41. Классификация антибиотиков по происхождению.1) из грибов, например рода Penicillium (пенициллин), рода Cephalosporium (цефалоспорины) 2)из актиномицетов; группа включает около 80% всех антибиотиков. Среди актиномицетов основное значение имеют представители рода Streptomyces, являющиеся продуцентами стрептомицина, эритромицина, левомицетина. 3)Антибиотики, продуцентами кт являются собственно бактерии.Bacillus и Pseudomonas,полимиксины, бацитрацины, грамицидин.4) животного происхождения; из рыбьего жира получают эктерицид, из молок рыб – экмолин, из эритроцитов – эритрин. 5) растительного происхождения. которые выделяют лук, чеснок, сосна, ель, сирень, другие растения. Антимикробным действием обладают многие растения, например, ромашка, шалфей, календула.

Вопрос 42

Бактерицидное или фунгицидное, вызывающие гибель бактерий или грибов (бета-лактамы, фторхинолоны,полиены)

Бактериостатические или фунгистатические (макролиды, тетрациклины, азолы)

Вопрос 43

Выделяют антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки бактерий, нарушающие структуру и синтез клеточных мембран, ингибиторы биосинтеза белка и дыхания, ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, процессов репликации, транскрипции и трансляции

Вопрос 45

На поверхность агаровой среды в чашке петри наносят бактериальную суспензию определённой плотности и затем помещают диски, содержащие антибиотики такой концентрации, которая обуславливает стандартный диаметр зон задержки роста чувствительных тест- бактерий. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате для лучшей диффузии препаратов в пит. Среду. Каждый диск прижимают пинцетом. Диски на равном расстоянии др от др 2-2,5 см от края чашки. При помещении диска на пит среду антибиотик диффундирует в агар. Большая конц антибиот наблюдается в месте диска. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. Чашки с посевом инкубируют в термостате 35-37гр в течение ночи. Результат учитывают путём измерения диаметра зоны торможения роста бактериальной культуры. Измерение производят циркулем или миллиметровой линейкой или спец трафаретом. При зоне задержки роста диаметром до 10мм штамм расценивается как малочувсвительный к исследуемому антибиотику; более 10мм-слабочувствительный; 10-20мм-чувствительный; более 20мм-высокочувствительный.

46.Метод серийных разведений: сущность сводится к выявлению роста исследуемой микробной культуры в ряде пробирок с питательной средой, содеджащий разные концентрации антисептиков. Этот метод определяет МПК, при кот. ингибируется рост изучаемого микроорганизма. Для разведения препаратов используют стандартные питательные среды (сердечно-мозговой бульон, рН 7,2-7,4), кот. обеспечивают оптимальные условия роста исследуемого вида и не содержат веществ, подавляющих действие антибиотиков. В приготовленные разведения препаратов вносят культуры микроорганизмов в логарифмической или ранней стационарной фазе роста. Для большинства патогенных видов бактерий этот период соответствует 16-18 часов роста. Бульонную культуру исследуемых бактерий в бульоне добавляют в объеме 1 мл к каждому разведению препарата. При э этом концентрация препарата в первом разведении становится в 2 раза ниже. Все исследования сопровождаются контролем – пробирка, содержащая 1 мл бульона и 1 мл культуры каждого испытуемого штамма без добавления препарата. После внесения микробной культуры штатив помещают в термостат и инкубируют при t= 37 C, 3-5 суток. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) свидетельствует о том, что данная кончентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения кнц. антиб. в руду пробиров рост микроорганизма ухудшается. МПК принято считать первую наименьшую концентрацию антибиотика, где визуально не определяется бактериальный рост.

ОСОБЕННОСТИ

n Бактерии - гаплоидные организмы, в связи с этим отсутствует явление доминантности.

n Хромосомы располагаются свободно в цитоплазме, суперспирализированы, уложены в виде кольца и прикреплены к ЦПМ.

n Передача генетического материала происходит по вертикали и горизонтали.

n Имеются внехромосомные факторы наследственности.

ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТЕРИЙ

ДНК

n нуклеоид (бактериальная

хромосома): жизненно важные признаки

n внехромосомные факторы наследственности: не жизненно важные признаки

ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ФАКТОРЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ

n автономные – являются репликоном: плазмиды

n неавтономные - реплицируются только в составе репликона (нуклеоида или плазмиды): транспозоны, IS-последовательности, умеренные фаги

ВСТРАИВАНИЕ В НУКЛЕОИД ВНЕХРОМОСОМНЫХ ФАКТОРОВ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ

n в гомологичных участках: плазмиды, умеренные фаги

n в любых участках: транспозоны, IS-последовательности

48. ПЛАЗМИДЫ -внехромосомные автономные кольцевые и суперспирализованные молекулы ДНК, размеры которых 1,5 до 200 мД

n функции

-регуляторная – компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида

-кодирующая – вносит в генотип новую информацию

n возможные состояния

-автономное (в цитоплазме)

-интегрированное (в нуклеоиде)

n строение

-Гены саморепликации

-Структурные гены

-Tra-оперон

n содержание tra-оперона

-Конъюгативные (трансмиссивные) плазмиды (содержат)

-неконъюгативные (мобилизируемые) плазмиды

ФУНКЦИИ TRA-ОПЕРОНА

n детерминирует образование конъюгативных пилей

n моблизирует на перенос

-саму конъюгативную плазмиду (F+)

-другую, неконъюгативную, плазмиду (RTF)

-участок нуклеоида (Hfr)

Виды плазмид и кодируемые признаки

-R-плазмиды - лекарственную устойчивость

-Col-плазмида-синтез колицинов

-Hly-плазмида –синтез гемолизинов

-Tox-плазмиды – синтез токсинов

-F-плазмида – передача генетической информации

-Плазмиды биодеградации – разрушение субстратов (белков, сахаров)

Общемедицинское значение плазмид

-Контролируют синтез факторов патогенности, в том числе у представителей нормальной микрофлоры тела человека

-Участвуют в распространении генов резистентности к химиотерапевтическим средствам и дезинфектантам, что лежит в основе формирования госпитальных штаммов

49.ТРАНСПОЗОНЫ -нуклеотидные последовательности (от 2 000 до 20 000 пар нуклеотидов), способные менять место своей локализации в молекуле ДНК и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую

n состояние в бактериальной клетке

1. интегрированное в репликон (реплицируется вместе с ним)

2. автономное (замыкается в кольцо и не реплицируется)

n состав

1. особые концевые структуры, которые отличают транспозон от др. фрагментов ДНК (маркеры транспозона)

2. гены транспозиции

3. гены, детерминирующие синтез

-токсинов

-ферментов, обеспечивающих устойчивость к антибиотику

-белков, обеспечивающих др. признаки

Функции транспозонов

1. координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации

2. регуляторная (регуляция транскрипции генов путём их «включения/выключения»)

3. индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5-9 пар нуклеотидов)

IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ_вставки нуклеотидных последовательностей (порядка 1 000 пар нуклеотидов)

n отличия от транспозонов

1. содержат только гены транспозиции

2. не обнаружены в свободном состоянии

n функции

1. координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации

2. регуляторная (регуляция транскрипции генов путём их «включения/выключения»)

3. индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5-9 пар нуклеотидов)

51.

Модификационная изменчивость вид изменчивости,которая не передается по наследству и изменения которой затрагивают лишь фенотип(.

Разлачают: 1)изменчивость,провляющаяся только при действии индуцирующего фактора.2)Сохраняющееся после действия фактора.эта делится на длительнаю,кратковременную.

Длительные-наблюдаются в течении ряда поколений после того,как индуцирующий фактор перестал действовать.

Кратковременные- сохраняются только в первых генерациях после устранения вызвавшего их фактора.

52.

Мутационная изменчивость.По происхождению: спонтанные(естественные) и индуцированные(эксперементальные). По локализации: хромосомные(несколько генов),генные,точковые.

В хромосомных выделяют: Делеции(выпадение большого кол-ва нуклеотидов),Инверсии(поворот уч-ка ДНК на 180),Дупликации(повторение уч-ка хромосомы).

Мутации,возникающие как следствие изменения в азотистых оснований в молекуле ДНК,приводят к утрате или изменению какой-либо функции.

 

53.

SR-диссоциация-появление в чистой культуре, образующей колоний S-формы, R-форм.

При этом изменение формы колонии является внешним проявлением изменений свойств образующих ее бактериальных клеток. У бактерий, в норме образующих R-формы колоний, также наблюдается диссоциация, которая, проявляется появлением S-форм колоний. Однако, механизм RS-диссоциации не известен и этот вид диссоциации здесь не рассматривается.

А. По своему механизму SR-диссоциация – это инсертационная мутация, приводящая к утрате генов, контролирующих синтез полисахаридных звеньев ЛПС наружной мембраны клеточной стенки. Из-за этого все свойства, функционально связанные с клеточной стенкой (форма, наличие капсулы и жгутиков, чувствительность к бактериофагам, метаболическая активность и т.д.) изменяются и как конечный результат – изменяется форма колонии.

Б. Диссоциация имеет для бактерий важное биологическое значение.

1. R-формы колоний более устойчивы к физико-химическим факторам внешней среды.

2. S-формы более устойчивы к фагоцитозу и действию антител.

В. Диссоциация значительно усложняет выделение и идентификацию чистой культуры. В этом заключается большое значение диссоциации для микробиологической диагностики.

МУТАГЕНЫ

Определение

Химические вещества или физические факторы, вызывающие предмутационные изменения в ДНК, которые в результате ошибок репарирующих ферментов или в процессе репарации переходят в мутацию.

1. Физические (УФ-излучение, R-лучи)

2. Химические (бензпирен, азид натрия, 5 бромурацил, 2 аминопурин, азотистая кислота)

3. Биологические (транспозоны, µ-бактериофаги, Is –элементы)

КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАГЕНОВ

По механизму действия

1. аналоги азотистых оснований ð замена пар оснований

2. акридиновые красители ð выпадения или вставки оснований

3. УФ, некоторые продукты микробного метаболизма ð нарушение работы ДНК-полимеразы ð образование тиминовых димеров

4. нитрозосоединения ð множественный эффект («супермутагены»)

55 РЕПАРАЦИИ

Определение

Процесс восстановления повреждённой ДНК ферментами репарационных систем

Виды репарационных систем

n Система фотореактивации – ферменты активны в присутствии видимого света

n Система темновой репарации – ферменты действуют в темноте

Этапы репарации

n Обнаружение и надрезание поврежденного фрагмента ДНК эндонуклеазой

n Удаление вырезанного фрагмента ДНК-полимеразой 1

n Синтез нуклеотидов по матрице второй сохранившейся нити – работает ДНК-полимераза 1 и 3

n «Сшивание» восстановленного фрагмента ДНК с основной нитью за счет лигазы

56 РЕКОМБИНАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ У БАКТЕРИЙ

Определение

Изменчивость, происходящая в результате включения в ДНК реципиентной клетки участка ДНК донорской клетки

Виды рекомбинаций

n Законная – происходит спаривание гомологичных генетических структур за счет образования водородных связей между комплементарными нуклеотидами

n Незаконная – при встраивании в любом месте ДНК бактерий транспозонов, Is - элементов