Робота 6. Визначення інтенсивності фотосинтезу за кількістю накопиченої сухої речовини ( метод листкових половинок )

 

Мета роботи. За зміною маси фотосинтезуючої частини листкової пластинки визначають збільшення у ній сухої речовини за одиницю часу.

Матеріали, реактиви, обладнання. Листки дослідних рослин; кри-сталізатор, свердла; бюкси; терези з різновагами; ковпачки з світлонепроникного паперу; термостат.

Основні відомості. Є багато різноманітних методів визначенняінтенсивності фотосинтезу: газометричний, евдіометричний, манометричний методи та метод листкових половинок Ю.Сакса.

Газометричний метод грунтується на підрахунку кількості поглинутого вуглекислого газу або виділеного кисню.

Евдіометричний метод полягає у визначенні інтенсивності фотосинтезу за допомогою асиміляційної колби, розроблений Л.О.Івановим і Н.Л.Косовичем.

Манометричний метод використовується для визначення інтенсивності фотосинтезу в природних умовах за допомогою польового приладу (ПСФ) за Х.М.Починком.

В умовах навчально-польової практики доступним методом визначення продуктивності фотосинтезу є метод листкових половинок Ю.Сакса. Суть цього методу полягає в тому, що за зміною маси фотосинтезуючої частини листкової пластинки визначають збільшення у ній сухої речовини за одиницю часу.

Визначається чиста продуктивність фотосинтезу, тобто накопичення сухої речовини за годину або добу на одиницю площі листків. Але для визначення чистої продуктивності необхідно паралельно визначати втрату сухої речовини на дихання і відтік асиміляторів.

Хід роботи. Для досліду вибирають рослини з великими листками симетричної будови, для аналізу беруть два непошкоджених супротивних листки. Одну половину зрізають, а другу, з центральною жилкою, залишають на рослині. Відрізану половинку кладуть у кристалізатор з водою на 30 хв. до повного насичення листка.Потім з цієї пластинки свердлом вирізають кілька висічок (8-10-12), залежно від діаметра свердла.

Висічки поміщають у зазделегідь зважені і пронумеровані металічні бюкси. Бюкси ставлять на 2 год в термостат для висушування висічок при температурі 70oС. Через 2 години бюкси охолоджують, зважують разом з висічками і знову ставлять у термостат на 30 хв. Так бюкси висушують до сталої ваги.

Розділивши масу висічок на їх площу одержуємо кількість сухої речовини на одиницю площі листка.

Через 4-6 годин відрізаємо другу половинку і здійснюєм ті самі операції, що й з першою. Збільшення маси в тих половинках листків, які залишались на світлі, свідчить про продуктивність фотосинтезу. Але цей підрахунок не враховує витрату сухої речовини, яка за час досліду була використана на дихання і відтік. А тому у супротивного листка вирізуємо половинку пластинки, а на другу надіваємо ковпачок з чорного паперу. З першою і другою половинками цього листка проводять ті самі досліди, що й з попередніми. При цьому визначаєм уже не приріст сухої речовини, а втрату її на одиницю площі за одиницю часу (1 годину). Цю величину додають до одержаної поперед-ньо, а точніше кількість втрати сухої речовини і відтоку додаєм до кількості приросту і одержуєм точніші дані щодо продуктивності фотосинтезу.

Враховуючи, що ці дослідження проводять побригадно і на різних об’єктах, то для порівняння доцільно одержані дані оформити у вигляді таблиці і зробити відповідний висновок.

 

Об’єкт	Приріст сухої речовини в процесі фотосинтезу, г	Втрата сухої речовини за рахунок дихання і відтоку, г	Продуктивність фото-синтезу, (г/см2- год.)

 

Контрольні запитання.

 

1.На чому грунтується визначення продуктивності фотосинтезу методом листових пластинок?

2.Чи має відношення до визначення продуктивності фотосинтезу процес дихання?

 

Робота 7. Методика визначення каталази по Починок.

Мета роботи. Визначити кількість каталази в різних рослинних об’єктах.

Матеріали, реактиви, обладнання. Торзійні терези, ножиці, фарфорові ступки з пестами, колби, мірні піпетки місткістю 5 мл, 20 мл; бюретки, термометр; 17%-й розчин Н₂О₂, 10%-й розчин Н₂SO₄, 25%-й розчин КІ, 10%-й розчин (NH₄)₂MoO₄, 0,01н. розчин Na₂S₂O₃, 1%-й розчин крохмалю.

Основні відомості. Каталаза - двокомпонентний фермент, роль якого в організмі полягає у руйнуванні отруйного для клітин пероксиду водню за таким рівнянням:

2Н₂О₂ ^{каталаза} ® 2Н₂О + О₂­.

На світловій фазі фотосинтезу, а точніше фотохімічному її етапі під дією енергії сонячного світла відбувається реакція фотолізу води, проміжною сполукою якого є пероксид водню. Саме каталаза клітин зеленого листка і знешкоджує отруйну дію пероксиду водню шляхом розщеплення одноразово двох молекул його на воду і молекулярний кисень, яким збагачується повітря. Отже, у фотосинтезуючих тканинах листків каталаза завжди присутня, тому листок і є вдалим об’єктом для визначення її активності.

Хід роботи. Наважку 200мг рослинного матеріалу розтирають у ступці, додають 20 мл Н₂О і все переносять у колбу, збовтують (для рівномірного розподілення).

5 мл цієї витяжки відбирають у колбу і додають 15 мл Н₂О при Т = 15°- 17°С. Потім у ту ж колбу додають: 5 мл 17%-го розчину Н₂О₂, через 5 хвилин додають 5 мл 10%-го розчину Н₂SО₄ для нейтралізації Н₂О₂. Н₂О₂, що не розклалась, відтитровуємо йодометрично, для чого додають 1 мл 25%-го розчину КІ та 3-4 краплі 10%-го розчину (NH₄)₂MoO₄ і титрують Na₂S₂O₃ (0,01н) до жовтого кольору, потім треба додати 1 мл 1%-го розчину крохмалю і титрувати до знебарвлення.

Одночасно ставлять контроль, для чого беруть 20 мл Н₂О, додають 5 мл Н₂О₂ і через 5 хвилин доливають 5 мл Н₂SО₄, потім також додають КІ і (NH₄)₂MoO₄.

Формула розрахунку:

І_ф = ^{(а - х)× в × А}

^{а × р × с}

І_ф - активність ферменту в мл;

а - кількість 0,01 н Na₂S₂O₃, мл, затрачених на контроль;

х - кількість 0,01 н Na₂S₂O₃, мл, затрачених на дослід;

в - реаційний об’єм (20 мл);

А - об’єм витяжки (20 мл);

р - наважка;

с - кількість мл суспензії, взятої на титрування (5 мл);

різниця (а - х) повинна бути в межах 3-5, в протилежному випадку необхідно брати більшу або меншу наважку.

Контрольні запитання.

Яка фізіологічна роль каталази?

Як продемонструвати дію каталази на розщеплення пероксиду водню в клітинах?

 

 

Робота 8. Вивчення динаміки накопичення крохмалю в листках у процесі фотосинтезу.

Мета роботи. Дослідити динаміку накопичення крохмалю в листках різних рослин.

Матеріали, реактиви, обладнання. Пробірки, водяна баня, спирт, свердла, розчин йоду в йодистому калії, листки паперу.

Основні відомості. Синтезована глюкоза у темновій фазі фотосинтезу полімеризується у молекули крохмалю, який відкладається в крохмальних зарнах. Оскільки крохмаль з йодом дає специфічну реакцію (посиніння) то саме ця реакція і використовується для виявлення динаміки накопичення крохмалю як первинного продукту фотосинтезу.

 

Хід роботи. Зранку на рослині, поярусно, відбирають по 2 супротивно розміщених листки. З однієї половинки (не пошкоджуючи центральної жилки) вирізають свердлом по 1 висічці. Висічки поміщають у окремі пробірки і негайно заливають невеликою кількістю спирту. Пробірки нумерують відповідно до схеми взятих проб і поміщають на водяну баню. Проби доводять до кипіння. Після знебарвлення листків спирт злити, висічки сполоснути водою і залити розчином йоду в йодистому калії. Посинілі висічки знову промити і розкласти на папері.

Зразу ж після того, як взяли перші проби, один із двох супротивних листків на кожному ярусі закривають світлонепроникним паперовим футляром. Через 1-1,5 години повторити проби на виявлення крохмалю у тій же послідовності. Зробити декілька повторних проб.

В результаті накопичення висічок і оцінки їх посиніння, можна бачити як протікає процес крохмалоутворення у листках на світлі і в темряві.

Для зручності аналізу і оцінки результатів дані, які отримали оформляють у вигляді таблиці:

 

		Час, коли брались проби і оцінка ступеня посиніння
Рослина	Ярус	8 00	9 00	10 00	11 00	12 00
Листок на світлі	1. 2. 3.
Листок в темряві	1. 2. 3.

 

Примітка: оцінку ступеня посиніння роблять за п’ятибальною системою.

 

Контрольні запитання.

1. З’ясувати процес утворення крохмалю як продукту фотосинтезу.

2. Поясніть послаблення синього забарвлення або зникнення його в листках, які були затемнені.

 

IV. Мінеральне живлення

Робота 9. Визначення об’єму кореневої системи методом Д.А.Сабініна і І.І.Колосова.

Мета роботи. Вивчити об’єми кореневих систем рослин, охарак-теризувати стан рослин за цим показником.

Матеріали, реактиви, обладнання. Дослідні рослини, дистильована вода, об’ємометр, кристалізатор, штатив, бюретка, фільтрувальний папір, нитки.

Основні відомості. Одним з показників, що характеризує кореневу систему рослин є об’єм її. Найпростіший і досить точний метод запропонували Д.А.Сабінін і І.І.Колосов. Метод полягає у підрахунку кількості води, яку витісняють корені під час занурення їх у мірний циліндр.

 

Хід роботи. На початку роботи монтують об’ємометр. Скляну цилі-ндричну посудину, нижня частина якої витягнута в трубку, з’єднують гумовою трубкою з градуйованою піпеткою на 1-2 мм. Об’єм циліндричної посудини підбирають за розміром кореневої системи. Посудину закріплюють на штативі. На тому ж штативі під невеликим кутом прикріплюють градуйовану піпетку. Скляні частини приладу вимивають хромовою сумішшю, заливають в нього дистильовану воду, рівень якої повинен бути на 2-3 см нижчий від верхнього краю посудини. Для перевірки роботи приладу доливають кілька крапель води в посудину і стежать за тим, чи відбувається плавне пересування меніска в піпетці. Якщо меніск не рухається, в гумовій трубці є повітря, яке необхідно видалити.

Рослини, відібрані для аналізу, складають в пучок, так щоб кореневі шийки були на одному рівні. Корені злегка просушують фільтрувальним папером, відмічають положення в піпетці меніска А і занурюють кореневу систему у воду. Після занурення коренів рівень води в циліндрі приладу підвищується і меніск в піпетці піднімається до положення В. Далі корені виймають і дають стекти воді з них у посудину. Якщо після стікання всієї води, рівень її в піпетці не досягає положення А, то не знімаючи нахилу піпетки, до-ливають воду у циліндр доти, поки меніск в піпетці знову не займе положення А. На штативі над посудиною закріплюють бюретку з дистильованою водою. Воду випускають в посудину, поки меніск не займе положення С. Долитий об’єм води з бюретки дорівнюватиме об’єму кореневої системи досліджуваних рослин. Визначення повторюють три рази і обчислюють середню величину, результати записують за формою:

Об’єкт	Відлік по бюретці	Кількість долитої води,	Об’єм кореневої
		мл	системи, мл

Контрольні запитання.

1. У чому полягає метод Д.А.Сабініна і І.І.Колосова по визначенню об’єму кореневої системи?

Тема V. Дихання рослин

Робота 10. Виявлення дегідрогеназ в різних тканинах рослин.

Мета роботи. Оволодіти методом визначення дегідрогеназної активності в різних тканинах рослин.

Матеріали, реактиви, обладнання. Проросле насіння гороху, 50 мг/л розчину метиленового синього, водяна баня з термометром або термостат, фарфорова чашка, пробірки з гумовими пробками, склограф.

Основні відомості. Дегідрогенази - це ферменти, що каталізують перенесення водню від субстрату, який окислюється, до акцептора, що має більш високий окислювально-відновний потенціал.

Є дві групи дегідрогеназ:

Анаеробні дегідрогенази - це двокомпонентні ферменти, коферментом яких може бути нікотинамідаденіндинуклеотид (НАД⁺). У процесі окислення субстрату НАД⁺ перетворюється на відновлену форму НАДН₂. До анаеробних НАД-залежних дегідрогеназ належать такі ферменти, як алкоголь-дегідрогеназа, лактатдегідрогеназа, металдегідрогеназа та ін. Анаеробні дегідрогенази передають водень, тобто електрон і протон, різним проміжним сполукам та аеробним дегідрогеназам.

Аеробні дегідрогенази це також двокомпонентні ферменти, які називають флавіновими. Крім білка до їх складу входять тісно зв’язані з ними простетичні групи - рибофлавін (вітамін В₂). Розрізняють два коферменти цієї групи: флавіномононуклеотид (ФМН) і флавінаденіндинуклеотид (ФАД). Прикладом дегідрогенази, до складу якої входить ФАД, є сукцинатдегідрогеназа.

Щоб визначити активність дегідрогеназ, як акцептор водню можна ви-користати метиленовий синій, який у процесі відновлення переходить у безбарвну лейкоформу:

С-Н₂ + М ® С + М -Н₂,

де С-Н₂ - субстрат; М - метиленовий синій; С - окислений субстрат; М -Н₂ - відновлена фарба.

При наявності молекулярного кисню лейкоформа метиленового синього окислюється самостійно і знову набуває свого кольору.

¹/₂ О₂ + 2Н⁺ + М ® М + Н₂О.

Хід роботи. Оголити від шкірки 10-12 насінин, що наклюнулися, та розділити на сім’ядолі. Половину матеріалу помістити в колбу з водою і кип’ятити протягом 3 хв. При цьому руйнуються ферментні системи, Потім матеріал, що кип’ятили, та свіжий переносять в дві пробірки і заливають розчином метиленового синього. Через 5-10 хв., коли сім’ядолі інтенсивно забарвляться, зливають розчин фарби, промивають матеріал водою, після чого матеріал заливають дистильованою водою і закривають пробками. Пробірки ставлять у термостат або на водяну баню при t = 25-30° C. Відмічають знебарвлення сім’ядолею в одній з пробірок, після чого сім’ядолі висипають у чашку Петрі або фарфорову (без води), залишають на повітрі і спостерігають відновлення забарвлення. Описують результати і роблять відповідні висновки.

Контрольні запитання.

1. Що таке дегідрогенази?

2. Що спільного і чим відрізняються анаеробні та аеробні дегідрогенази?

3. В чому полягають принципи визначення активності дегідрогеназ?

 

 

 

Тема V. Стійкість рослин