Якісне відкриття і кількісне дослідження азотовмісних речовин м’яса

9.1. Якісне відкриття окремих азотовмісних речовин м'яса

Мета: Освоїти принципи, методи та хід визначення якісного і кількісного складу азотовмісних речовин м'яса.

Завдання: Оволодіти методиками якісного відкриття окремих азотовмісних речовин.

Матеріали та обладнання: пробірки, мірні піпетки, колби різної ємності, шпателі, лопатки, ваги торсійні, дослідні зразки, робочі зошити, 10%-ний розчин їдкого натра, 0,1%-ний розчин сірчанокислої міді, конц. азотна кислота, конц. Розчин аміаку, реактив Неслера, індикатори паперові,, метиловий спирт, 0,15 М фосфатний буфер з рН 6,5, що містить хлористий калій у 0,3 М концентрації, дистильована вода, фільтри паперові, марля, магнітна мішалка, центрифуга, холодильна камера, концентрована сірчана кислота Н₂SО₄ (питома маса 1,84, ДСТ 4204—77, х.ч.); децинормальний (0,1 н) розчин Н₂SО₄; борна кислота Н₃ВО₃(ДСТ 9656—61, х.ч.), з якої готують 2 %-ний розчин; соляна кислота (НС1, х. ч.), 33 %-ний розчин NаОН, сірчанокисла мідь — СuSО₄-5Н₂О (ДСТ 4165-66, х. ч.); сірчанокислий калій — К₂SО₄ (ДСТ 4145—65, х.ч.); селен елементарний; селеновий каталізатор (розтирають і змішують 100 г сірчанокислого калію, 10 г сірчанокислої міді і 2 г селену. За відсутності селену застосовують суміші сірчанокислої міді і сірчанокислого калію); індикатори: Таширо, конгорот, метилоранж, 0,6 % розчин хлористого натру, 0,2% розчин їдкого натру, 0,1% розчин їдкого натру, реактиви для визначення азоту, 20% розчин оцтової кислоти, водяна баня, центрифуга, фільтрувальний папір, вата, тести рН, колби на 100 та 200мл.

Для приготування індикатора Таширо 0,02 г метилового червоного розчиняють у 60 мл етилового спирту, потім додають 40 мл води. Після цього 0,1мг метиленової сині розчиняють у 100 мл води. Перед роботою змішують 25 мл метилового червоного і 3 мл розчину метиленової сині; дистильована вода; лакмусовий папір (червоний); пемза порошкоподібна чи гранульована (можна використовувати скляні чи порцелянові трубочки); ваги аналітичні, циліндрик на 10 мл для відбору наважки корму або іншого субстрату; колби Кьельдаля (для спалювання - ємністю 200-250 мл, для відгону - ємністю 500-750 мл); штатив для колб, що використовується при спалюванні корму; відгінний апарат Кьельдаля (для відгону аміаку), колбонагрівачі чи інше джерело нагрівання, бюретки на 25-50 мл, мірні циліндри ємністю 25-50 мл; установка для титрованих розчинів; колби конічні чи мірні на 250-500 мл; крапельниця для індикатора; краплеутворювачі; прилад для промивання.

9.2. Біуретова реакція (реакція Піотровського) на полі пептиди і білки

В сильно лужному розчині при додаванні солі міді такі речовини, як біурет (Н₂N-СО-NН-СО-NН₂), полі пептиди і білки утворюють забарвлений в синьо-фіолетовий та червоно-фіолетовий колір комплексні солі.

Біохімічне підґрунтя. Біуретова реакція обумовлена присутністю в молекулі або двох -СО-NН – груп або -СО-NН – групи і груп –С-(-NН)-NН₂ або –СН₂-NН, пов’язаних безпосередньо між собою або через атом вуглецю або азоту. Тому біуретову реакцію дають пептиди, що містять принаймні, три залишки амінокислот. Проте, деякі непептидні структури, як, наприклад, гистидин, дають позитивну біуретову реакцію і тому ця реакція не є специфічною для поліпептидних ланцюгів.

Пептони при звичайному проведенні біуретової реакції дають червонувате забарвлення. Однак і тут при додаванні надлишку солі міді утворюється синьо-фіолетове забарвлення.

Присутність у досліджуваному розчині сульфатів магнію або амонію перешкоджає біуретовій реакції. При наявності амонійних солей слід використовувати великий надлишок їдкого лугу. Біуретова реакція використовується і для кількісного визначення білків.

Техніка визначення. До водного екстракту м’язів додають рівний об’єм 10%-ного розчину їдкого натра і потім по краплях 0,1%-ний розчин сірчанокислої міді. Рідина набуває фіолетового забарвлення.

Результати аналізу записують у форму 6.

9.3. Ксантопротеїнова реакція (на тирозин, триптофан, фенілаланін)

Біохімічне підґрунтя. Якщо з’єднати розчин білку з концентрованою азотною кислотою, то випаде осад білку, який при нагріванні суміші частково розчиняється з утворенням жовтого розчину. При цьому відбувається утворення нітросполук триптофану та тирозину. Якщо далі до отриманого розчину обережно додати розчин їдкого лугу чи аміаку, то з’явиться червонувато-оранжеве забарвлення. Це забарвлення обумовлено утворенням солей таутомерних ациформ нітросполук – нітронових кислот.

Триптофан дає більш яскраво-червоне забарвлення, ніж тирозин. Фенілаланін не нітрується при дії однієї азотної кислоти, проте при додаванні концентрованих сірчаної і азотної кислот нітрування відбувається. Ксантопротеїнова реакція виходить краще з сухими препаратами білка.

Техніка визначення. До екстракту м’язів або сухого залишку додати по краплях концентровану азотну кислоту і потім нагріти до кипіння. Після охолодження обережно додати по краплях концентрований розчин їдкого натра або аміаку. При наявності циклічних амінокислот з’являється оранжево-червоне забарвлення.

Провести експеримент з дослідним зразком. Результати експерименту занести у форму 6, зробити короткий висновок.

9.4. Якісна реакція на триптофан з гліоксілевою кислотою

Біохімічне підґрунтя. Кольорова реакція на триптофан відбувається в наслідок взаємодії триптофану з глиоксилевою кислотою (СОНСООН), яка знаходиться у вигляді домішки в льодяній оцтовій кислоті. Тому замість льодяної оцтової кислоти для реакції можна використовувати розчин чистої гліоксілевої кислоти. Сліди міді в реакції значно підвищують інтенсивність утвореного забарвлення.

Техніка визначення. До екстракту м’язів додати в надлишку льодяну оцтову кислоту, підігріти до повного розчинення і після охолодження обережно додати концентровану сірчану кислоту. На межі двох шарів після деякого відстоювання з’являється червоно-фіолетове забарвлення.

9.5. Якісна реакція на аміак

Біохімічне підґрунтя. Реакція дозволяє виявити аміак чи солі його в екстракті м’язів в кількості, що перевищує природну концентрацію. Метод ґрунтується на зміні кольору екстракту при взаємодії аміаку з реактивом Неслера.

Техніка визначення. У хімічну склянку відмірюють 2 мл екстракту м’язів і додають 1 мл реактиву Неслера. Суміш ретельно перемішують протягом 1 хв. Спостерігають за зміною забарвлення. При наявності у м’ясі кінцевого продукту розпаду білка (аміаку) в надпорогових концентраціях колір рідини змінюється на жовто-гарячий.

Таблиця 16