Тема 19. 1. Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных нейротропными вирусами и прионами

А План

А Программа

1. Биологические свойства возбудителей нейровирусных инфекций, их патогенность, экология, особенность инфекций и эпидемиология вызываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика.

3. Диагностические и лечебно-профилактические пре­параты.

А Демонстрация

1. Тельца Негри при бешенстве.

2. Электронно-микроскопические фотографии нейрови-русов.

3. Диагностические и лечебно-профилактические пре­параты.

А Задания студентам

1. Указать материал для исследования при нейровирус­ных инфекциях.

2. Ознакомиться с бланками-направлениями на исследо­вание материала в вирусологическую лабораторию.

3. Сделать выводы по результатам реакции нейтрализа­ции выделенного от больного вируса с моновалентны­ми иммунными сыворотками против вирусов полио­миелита I, II и III типов.

4. Оценить результаты реакции нейтрализации выделен­ного вируса моновалентными иммунными сыворотка­ми против вирусов ECHO серотипов 9—16.

5. Оценить результаты реакции нейтрализации с парны­ми сыворотками крови больного и антигенами виру­сов Коксаки для серодиагностики.

 

6. Учесть результаты РСК с парными сыворотками боль­ного энцефалитом и обосновать диагноз заболевания.

7. Учесть результаты РСК с парными сыворотками боль­ного для серодиагностики полиомиелита.

8. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профилак­тическими препаратами, указать механизм действия.

А Методические указания

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных энтеровирусами (полиовирусы, вирусы Коксаки и ECHO)

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: смывы из зева (пер­вые дни болезни), фекалии; спинномозговая жидкость (при менингите).

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусологическое исследование. Является ведущим методом диагностики энтеровирусных инфекций. Выделение энтерови-русов (за исключением вирусов Коксаки типа А) из исследуе­мого материала осуществляют путем заражения клеточных культур. Для уничтожения сопутствующей бактериальной мик­рофлоры нестерильный материал (испражнения, глоточные смывы) предварительно обрабатывают антибиотиками (смесь пенициллина со стрептомицином, содержащая по 1000 ЕД/мл каждого антибиотика в растворе Хенкса) в течение суток при 4 °С, после чего проводят контрольный посев на стерильность. При сохранении бактериальной флоры материал повторно об­рабатывают теми же антибиотиками. Затем одновременно за­ражают по 2—3 пробирки с первичной (эмбриональные фиб-робласты человека или клетки почек обезьян) и перевиваемой культурой клеток (HeLa, амниона человека или др.), поскольку одни серотипы энтеровирусов лучше репродуцируются в пер­вичных, другие — в перевиваемых клетках.

Индикацию вирусов проводят по ЦПД: на 2—3-й день ин­кубации при 35 °С наблюдается полная или частичная дегене­рация клеток. При этом интенсивность ЦПД зависит от дозы вируса, типа культуры клеток и других причин. В случае от­сутствия ЦПД проводят дополнительно 2—3 пассажа. Основ­ным методом идентификации выделенного вируса является серотипирование в реакции нейтрализации (табл. 19.1.1; 19.1.2; 19.1.3). С этой целью материал из чистой культуры выделен­ного вируса обрабатывают смесью диагностических монова­лентных сывороток к различным серотипам энтеровирусов. При нейтрализации вируса в последующих пересевах ЦПД исчезает. Затем проводят реакцию нейтрализации с монова­лентными сыворотками. При этом в начале определяют тип вируса (полиовирус, Коксаки или ECHO), а затем его принад­лежность к определенному серотипу.

Таблица 19.1.1. Результаты реакции нейтрализации выделенных от больных вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам полиомиелита I—III типов

 

 

 

 

Сыворотка к вирусам полиомие-	Наличие ЦПД			Тип выде­ленного вируса
исследуемый материал		конт­роль сыво-
	2-й	3-й	4-й	5-й	6-й	7-й	миелита
	день	день	день	день	день	день	ротки
I II — — + +++ ++++	++++		I
III — — ++ +++ ++++	++++	—
Контроль — + ++ +++ ++++	++++
вируса

Условные обозначения: (++++) —выраженная дегенерация кле­ток с их отслаиванием от стенок пробирки; (+++) — менее выраженная дегенерация клеток с частичным отслаиванием от стенок пробирки; (+.+) — наличие не более 50 % дегенерированных клеток; (+) — наличие одиночных дегенерированных клеток; (—) — отсутствие ЦПД.

Таблица 19.1.2. Результаты реакции нейтрализации вьщеленных от больных вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам Коксаки

 

 

 

 

Сыворот-			Наличие ЦПД			Тип
сам Кок­саки		исследуемый материал		конт­роль сыво­ротки	го вируса Коксаки
2-й день	3-й день	4-й день	5-й день	6-й день	7-й день
В-1	—	+ +	+++	++++	++++	—
В-2	—	++ +++	+++	++++	++++	—
В-3	—	— —	—	—	—	—	Коксаки В-3
В-4	—	+ + +	+++	++++	+++ +	__
В-5	—	++ + +	+++	++++	+ + + +	—
В-6	—	+ ++	+++	++++	++ + +	—
Контроль вируса	—	++ +-Н-	+++	++++	+++ +	—

Условные обозначения: те же, что и в табл. 19.1.1.

Некоторые энтеровирусы (вирусы ECHO серотипов 3, 6, 7; Коксаки А серотипов 20 и 21; Коксаки В серотипов 1 и 5) обладают гемагглютинирующими свойствами. Их идентифици­руют в РТГА. Для идентификации применяют и другие методы (ИФ, ИФА, метод ДНК-зондов и др.).

 

Необходимо помнить, что положительный результат виру­сологического исследования имеет абсолютную диагностичес­кую ценность только в случае выделения вируса из стерильного материала (спинномозговая жидкость, кровь, биоптаты орга­нов), поскольку бессимптомное носительство широко распро­странено (до 50 % здорового населения). При обнаружении вируса в испражнениях или глоточных смывах необходимо серологическое подтверждение диагноза.

Биопроба. Для выделения вирусов Коксаки А, которые пло­хо репродуцируются в культурах клеток, применяют биопробу — исследуемым материалом заражают новорожденных белых мы­шей. В положительном случае у зараженных животных на 3—5-й день развиваются вялые параличи. Идентификацию этих вирусов проводят в РН на новорожденных мышах с мо­новалентными диагностическими сыворотками против различ­ных серотипов вирусов Коксаки А.

Экспресс-методы диагностики. Молекулярно-биологи-ческие исследования. РНК вирусов в исследуемом мате­риале обнаруживают методом гибридизации НК (ДНК-зондов).

Серодиагностика. С диагностической целью в крови больных определяют наличие специфических противовирусных имму­ноглобулинов класса М (IgM) с помощью ИФА. Для ретроспек­тивного подтверждения диагноза применяют также метод парных сывороток. С этой целью кровь у больного берут дважды: в первые дни болезни и через 3—4 нед. Раннюю сыворотку сохра­няют в холодильнике и реакцию ставят одновременно с обеими сыворотками. Антитела определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток с эталонными штаммами энтеровирусов, при­надлежащих к тем серотипам, которые чаще всего выделяют от больных (табл. 19.1.4). Для серодиагностики заболеваний, вы­званных гемагглютинирующими вирусами Коксаки, используют РТГА. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза. При обнаружении антител, соответствующих серотипу выделенного вируса, диагноз считается подтвержденным.

• Микробиологическая диагностика весенне-летнего клещево­го энцефалита

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Серодиагностика. Обнаружение противовирусных антител в крови больного является основным методом диагностики кле­щевого энцефалита, поскольку к моменту появления симптомов заболевания период вирусемии заканчивается. Выделение вируса из спинномозговой жидкости редко бывает успешным. Для се­родиагностики применяют метод парных сывороток. Используют РН, РСК, РТГА, реакцию латекс-агглютинации, ИФА и другие

реакции со стандартными вирусными антигенами. Диагности­ческое значение имеет нарастание титра специфических анти­тел не менее чем в 4 раза. Оценку результатов производят с учетом анамнестических данных: вакцинация, пассивная им­мунизация (введение противоэнцефалитной сыворотки или иммуноглобулина).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические ис­следования. С целью экспресс-диагностики клещевого энце­фалита применяют методы определения зараженности клеща, извлеченного из места укуса. Основным методом является ИФ. Готовят мазки-отпечатки и обрабатывают флюоресцирующими антителами к антигенам вируса клещевого энцефалита. В по­ложительном случае наблюдается специфическое свечение скоплений вирусных антигенов внутри клеток, присутствую­щих в материале. Наличие антигенов вируса в организме клеща можно определить и с помощью других иммунологических методов (РНГА со взвесью исследуемого материала и эритро­цитами, нагруженными антителами к вирусу клещевого энце­фалита, ИФА и др.). Предварительный ответ получают спустя 2-3 ч.