Глава 2. Физиология микроорганизмов

Химический состав микроорганизмов. Физиологические, обменные процессы тесно связаны с химическим составом микробной клетки. В нее входят химические элементы — органогены: азот, углерод, кислород, водород. Из этих элементов и их соединений микроорганизмы синтезируют белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, ферменты, витамины и др.

Составными частями бактериальной клетки являются вода (до 75-80%) в свободном или связанном виде, минеральные вещества, в том числе неорганической природы (фосфор, сера, натрий, магний, калий, кальций, железо, хлор и др.), а также микроэлементы (молибден, кобальт, бор, марганец, цинк, медь и др.), органические вещества — белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, ферменты и другие соединения.

Белки — жизненно важные вещества бактериальной клетки: простые белки — протеины; сложные белки — протеиды — соединения протеинов с небелковыми группами: с нуклеиновой кислотой (нуклеопротеиды), полисахаридами (глюкопротеиды), жироподобными веществами (липопротеиды); ферменты (энзимы), которые тоже являются белками.

Нуклеиновые кислоты представлены РНК, которая содержится в цитоплазме бактерий, и ДНК, находящейся в основном в ядре клеток. РНК играет роль в синтезе белка. ДНК отвечает за наследственные функции.

Углеводы содержатся в виде полисахаридного комплекса в соединении с белками и липидами в оболочках клетки и слизистом слое. Полисахаридные фракции обеспечивают специфичность микроорганизмов, что имеет большое значение для диагностики.

В жизни бактериальной клетки определенное место занимают также липиды (жирные кислоты, нейтральные жиры, фосфолипиды и др.).

Химический состав микроорганизмов зависит от состава питательной среды, характера обмена и внешних условий.

Химический состав актиномицетов и спирохет сходен с бактериями, имеются различия лишь количественного характера. Риккетсии содержат простые и сложные белки, углеводы, липиды, ферменты, а также аналогичные бактериям две нуклеиновые кислоты: ДНК и РНК.

Обмен веществ (питание) микробов. Микроорганизмы осуществляют постоянный обмен веществ с внешней средой. Для своего питания они извлекают из внешней среды питательные материалы, синтезируют составные части микробной клетки и получают за счет превращения веществ необходимую энергию для своей жизнедеятельности.

Питательные вещества поступают в клетку через ее оболочку; ненужные микробу продукты обмена также через оболочку выводятся наружу. Механизм этого явления основан на разнице осмотического давления в клетке и вне ее. Оболочка полупроницаема — пропускает воду и растворенные в ней питательные вещества. Для проникновения в клетку сложных коллоидных веществ требуется предварительное их расщепление, что осуществляется с помощью ферментов микробной клетки. Синтезированные в теле клетки белки используются как пластический материал.

Разница в концентрации питательных веществ обеспечивает движение воды и растворенных в ней соединений, причем вода движется в сторону более высокой, а соли — в сторону менее высокой их концентрации. Приток воды в микробную клетку вызывает набухание коллоидов цитоплазмы. В результате этого она тесно примыкает к оболочке клетки, находится в состоянии напряжения, именуемом тургором бактериальной клетки. Если изменить осмотическое давление в окружающей среде, например, поместить клетку в гипертонический раствор, то наступит обезвоживание и сморщивание — плазмолиз, в гипотонический раствор — набухание и разрыв — плазмоптиз. И в том и в другом случае микробная клетка гибнет. Эти свойства, в частности плазмолиз, используют в повседневной практике при консервировании пищевых продуктов в крепких растворах соли и сахара.

По типу питания микроорганизмы делят на аутотрофы (литотрофы) и гетеротрофы (органотрофы).

Аутотрофы для своего питания не нуждаются в готовых органических веществах, а создают их из неорганических веществ; в частности, углерод воспринимают непосредственно из диоксида углерода, простые азотистые соединения (аммиак, его соли, соли азотистой кислоты) и воду — из окружающей среды. Создание сложных органических веществ в клетках этих бактерий происходит путем хемо- или фотосинтеза. К этой группе микроорганизмов принадлежат нитрифицирующие бактерии, железобактерии, серобактерии и др. Патогенных для животных микробов в этой группе нет. Явление хемосинтеза у аутотрофных бактерий открыл отечественный микробиолог С.Н. Виноградский (1856-1953).

Гетеротрофы для своего питания воспринимают углерод только из готовых органических веществ. Они нуждаются в различных азотистых соединениях (нитраты, аммиак), неорганических веществах, микроэлементах и витаминах. Гетеротрофы подразделяют на сапрофитов и паразитов. Сапрофиты (метатрофы) используют мертвые органические субстраты, в основном это гнилостные микробы. Паразиты (паратрофы) — болезнетворные микробы, обитающие в живых тканях человека, животных, растений. Резкой грани между аутотрофами и гетеротрофами, а также между сапрофитами и паразитами не существует. При изменении условий среды меняется обмен веществ, у микробов вырабатываются адаптивные ферменты, и они приспосабливаются к другому типу литания. В экспериментах установлена смена аутотрофного на гетеротрофный тип питания. С другой стороны, отдельные виды патогенных для животных микробов могут существовать во внешней среде как сапрофиты, а некоторые сапрофиты при определенных условиях вызывают заболевание животных.

Отмечается избирательность микроорганизмов по отношению к питательным веществам, в особенности к источникам углерода и азота. Углерод микроорганизмы получают из углеводов, спиртов, различных органических кислот. Для выращивания патогенных микробов нужен азот белков животного происхождения, хотя удается выращивание и на синтетических средах. Универсальным источником азота и углерода служит пептон — продукт ферментного расщепления белков мяса. Он входит в состав питательных сред для выращивания бактерий. Бактерии нуждаются в специальных ростовых веществах или витаминах, играющих роль катализаторов биохимических процессов в клетке. Необходимы для питания бактерий также неорганические вещества.

Обмен веществ включает в себя два противоположных и в то же время единых процесса: ассимиляция (конструктивный обмен веществ) и диссимиляция (энергетический обмен веществ). Осуществляется обмен веществ с помощью ферментов.

Микроорганизмы нуждаются в аминокислотах.

Белковый обмен у бактерий протекает в две фазы. Под действием ферментов белковые вещества расщепляются до аминокислот. Последние могут подвергаться дальнейшему изменению (дезаминирование, декарбоксилирование). Наряду с этим происходит и процесс построения белков, для осуществления которого также необходимы аминокислоты. Одни микробы получают их в готовом виде, другие — синтезируют из простых соединений азота. Синтез белка осуществляется в рибосомах.

Расщепление углеводов также происходит под влиянием ферментов. Процесс протекает по типу гидролиза или фосфоролиза. Образующиеся моносахариды подвергаются брожению, при этом освобождается энергия, используемая микроорганизмами. Конечные продукты такого распада — вода и углекислота. Расщепление углеводов обусловливает кислую реакцию (бродильные микробы), расщепление белков — щелочную (гнилостные микробы). Этот биологический антагонизм широко используется в жизни — бродильные процессы предохраняют от загнивания силос, квашеные овощи, молочнокислые продукты. Углеводы синтезируются путем фотосинтеза, что присуще бактериям, содержащим в цитоплазме пигменты типа хлорофилла, и хемосинтеза, присущего большинству бактерий.

Липидный обмен в микробной клетке осуществляется с помощью ферментов. Многие бактерии усваивают глицерин, служащий для получения энергии и построения структур клетки.

Большое значение для жизнедеятельности микробов имеет также минеральный обмен.

Дыхание микроорганизмов. Это — процесс, сопровождающийся выделением энергии, необходимой микробам для синтеза органических соединений. По типу дыхания микробов делят на аэробные микробы (аэробы), использующие для дыхания молекулярный кислород воздуха (например, возбудитель сибирской язвы), и на анаэробные микробы (анаэробы), для жизнедеятельности которых необходимая энергия освобождается в процессе расщепления имеющихся в окружающей среде органических субстратов (например, возбудитель ботулизма). Между этими группами существуют промежуточные формы: микроаэрофилы — нуждаются в очень ограниченном количестве кислорода (например, возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота), и факультативные аэробы — размножаются как в присутствии, так и в отсутствие кислорода. Кним принадлежит большинство патогенных и сапрофитных бактерий. Значительно влияет на характер дыхания среда обитания микробов. Например, дрожжи могут изменять анаэробный тип дыхания на аэробный.

Процессы дыхания у бактерий представляют собой цепь последовательных окислительно-восстановительных реакций, протекающих с участием строго специфических ферментных систем и осуществляемых путем переноса электронов от систем с наиболее отрицательным потенциалом к системе с наиболее положительным потенциалом.

Ферменты (энзимы) микробов. Это — вещества, стимулирующие различные химические процессы, происходящие в клетке, а также в окружающей среде под их влиянием. Обладают высокой активностью и специфичностью. Они неустойчивы, разрушаются под действием высокой температуры, в присутствии щелочей, кислот, солей тяжелых металлов. Различают экзоферменты, выделяемые клеткой в окружающую среду для внешнего переваривания питательных веществ, и эндоферменты, которые заключены внутри клетки. Ферменты, находящиеся в клетке постоянно, независимо от условий ее существования, — конструктивные ферменты; другие ферменты — адаптивные (индуктивные) — появляются тогда, когда в них возникает необходимость. По химическому составу различают ферменты, состоящие только из белка, и ферменты, в состав которых помимо белка входят и другие вещества, например ионы металлов, витамины.

Ферменты широко применяются в промышленности: пивоварении, спиртовом производстве, хлебопечении, при выделке кож. Фибролизином растворяют тромбы в кровеносных сосудах. Ферменты, гидролизующие клетчатку, используют для лучшего усвоения животными грубых кормов. Ферментативные свойства патогенных микробов учитывают при их идентификации в лабораторной практике.

Токсины микроорганизмов. Ряд патогенных микробов вырабатывают особые ядовитые вещества — токсины. Их делят на экзотоксины, выделяемые во внешнюю среду, и эндотоксины, связанные с телом микробной клетки (подробно см. в главе 1«Учение об инфекции» раздела II).

Гнилостный распад белка (например, мяса), вызываемый определенными микробами, обусловливает образование ядовитых веществ — птомаинов, что служит причиной алиментарных интоксикаций.

Некоторые виды бактерий и грибов вырабатывают красящие вещества — пигменты. Колонии этих микробов на твердых средах окрашиваются в разные цвета: красный (чудесная палочка), синий (синегнойная палочка), золотистый (золотистый стафилококк), белый (белый стафилококк), черный и бурый (дрожжи и грибы). Есть микробы, которым свойственно свечение (люминесценция). Это — фотобактерии. Они вызывают свечение истлевшего дерева, мяса, чешуи рыб, морской воды и других объектов. Некоторые микробы выделяют летучие ароматические вещества, обусловливающие запах вин, молочнокислых продуктов, сена и других объектов. К ним относится Leuconostoc citrovorus, используемый в молочной промышленности для придания аромата сливочному маслу и другим молочным продуктам. Существует также группа термогенных (термофильных) микробов, способных при определенных условиях вызывать повышение температуры, обусловливая, например, самонагревание навоза, влажного сена. Микробные процессы сбраживания навоза сопровождаются выделением метана, который используется для отопления помещений.

Размножение и рост микроорганизмов. Размножение микробов — увеличение количества микробных клеток в единице объема, рост — увеличение самой клетки (увеличение массы цитоплазмы). Бактерии размножаются простым поперечным делением, например, палочковидные бактерии делятся на две особи. Кроме того, бактерии могут размножаться почкованием, путем расщепления сегментированных нитей, посредством образования клеток, подобных спорам, и другими способами. Актиномицеты и грибы размножаются в основном спорами. Дочерние клетки отделяются от материнских и, в свою очередь, становятся материнскими. После нескольких генераций материнские клетки стареют и гибнут.

Бактерии размножаются очень быстро. Длительность генерации у кишечной палочки всего 15 мин. Скорость деления зависит от вида бактерий, возраста культуры, питательной среды, температуры и других факторов. Размножение бактерий в жидких средах идет по определенным закономерностям и в несколько фаз (рис. 4):

I. Исходная фаза; длится 2 ч, размножения не происходит.

II. Фаза задержки размножения (лаг-фаза) — клетки приспосабливаются к новым условиям, скорость их роста возрастает; длится 2 ч.

Рис. 4. Фазы размножения бактерий

III. Логарифмическая фаза — максимальная скорость деления и уменьшение размеров клеток; длится 5-6 ч.

IV. Фаза отрицательного ускорения — снижение

скорости размножения бактерий, число делящихся клеток уменьшается; длится 2 ч.

V. Стационарная фаза — число новых бактерий становится равным числу отмирающих; длится 2 ч.

VI. Фаза ускорения гибели бактерий; длится 3 ч.

VII. Фаза логарифмической гибели — отмирание бактерий идет с постоянной скоростью; длится 5 ч.

VIII. Фаза уменьшения скорости отмирания, при которой оставшиеся живыми клетки переходят в состояние покоя.

Бактерии выращивают в питательных средах, используя для этого термостаты — приборы, где поддерживается определенная постоянная температура. Микробы способны размножаться при температуре от 4 до 80 °С; патогенные, как правило, при 37 °С.

Большое значение для выращивания бактерий имеет рН — концентрация водородных ионов. Большинство патогенных микробов растет при рН 6,8-8,0.

Питательные среды бывают простыми (мясо-пептонный бульон и агар), специальными (сывороточный агар и бульон, кровяные среды) и дифференциально-диагностическими (среды с углеводами, среда Эндо и др.). Среды, на которых хорошо растут определенные виды бактерий и не растут или плохо растут другие виды, называют элективными.

Различают плотные, жидкие и полужидкие среды. Бактерии на плотных средах образуют скопления, называемые колониями. Колонии могут иметь различные вид, цвет, размер, форму, края, поверхность. Эти признаки используются в лабораторной практике для дифференциации бактерий. На жидких средах бактерии растут с образованием помутнения, пленки, осадка. В лабораториях выращивают бактерий в пробирках, флаконах, колбах, чашках Петри; в производственных условиях — в стеклянных матрасах, бутылях, реакторах большой вместимости. Риккетсии культивируют в куриных эмбрионах, на искусственных питательных средах, содержащих переживающие ткани, и путем заражения лабораторных животных.

В настоящее время возросло значение микробиологической промышленности, производящей различные биопрепараты — вакцины, сыворотки и др. Ее основу составляет биотехнология — отрасль науки, разрабатывающая технологию производства (процессы, аппараты) биопрепаратов в промышленных масштабах. Наряду с традиционными возникли новые направления биотехнологии, в частности генетическая инженерия, позволяющая придавать микробам новые свойства и повышать выход продукции.

Лабораторная работа.

Приготовление простых питательных сред.
Изучение лабораторной аппаратуры и правил пользования ею

Простые питательные среды — мясо-пептонный бульон и агар — готовят на мясной воде.

Мясная вода. Мясо освобождают от костей, жира, пленок и сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают 2- или 4-кратным количеством воды (по массе) и кипятят в течение 1 ч. Жидкость фильтруют через вату или полотно, затем через фильтровальную бумагу. Фильтрат измеряют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой.

Другой способ — мясной фарш заливают 2- или 4-кратным количеством дистиллированной воды, тщательно перемешивают и оставляют на сутки в прохладном месте. На следующий день фарш отжимают, настой кипятят 30 мин и фильтруют.

Приготовленную мясную воду разливают по бутылкам и стерилизуют 30-40 мин в автоклаве при давлении 100 кПа (1 атм).

Мясо-пептонный бульон (МПБ). К мясной воде добавляют 1% пептона, 0,5% химически чистой поваренной соли и кипятят до растворения пептона. Затем в горячем бульоне определяют рН и добавлением 10%-ного раствора углекислой соды или децинормального (0,1 н.) раствора едкого натра устанавливают рН 7,2-7,4. После этого бульон еще раз кипятят 15-20 мин и фильтруют через двойной бумажный фильтр. Готовый бульон разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при давлении 100 кПа (1 атм)

Мясо-пептонный агар (МПА). В мясо-пептонный бульон добавляют 2-3% агар-агара и расплавляют его нагреванием в автоклаве или текучепаровом аппарате. В расплавленном агаре определяют рН и устанавливают его равным 7,2-7,4 добавлением 10%-ного раствора углекислой соды или децинормального раствора едкого натра. Для просветления среды добавляют на 1 л расплавленного и охлажденного до 50 °С агара белок одного куриного яйца или К) мл кровяной сыворотки, после чего нагревают в автоклаве при температуре 105 °С для свертывания белка, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр (в нагретом автоклаве), разливают по колбам и пробиркам, затем стерилизуют в автоклаве при давлении 100 кПа (1 атм) в течение 30 мин.

Определение рН (реакции) питательной среды. Применяют два метода: колориметрический и электрометрический. Принцип определения рН колориметрическим способом (по Михаэлису) заключается в сравнении окраски среды после добавления в нее индикатора с окраской готовой шкалы запаянных пробирок с различными показателями рН (отличаются по цвету). Для определения рН применяют индикаторы нитрофенолового ряда. Так как питательные среды для выращивания микробов в большинстве случаев имеют слабощелочную реакцию, при определении рН пользуются индикаторами ряда метанитрофенола, которым определяют рН от 6,7 до 8,4. Растворы индикатора готовят на дистиллированной воде и хранят в бутылях с притертыми пробками. Сравнение окраски среды и стандарта проводят в компараторе. Меняя стандартные пробирки, подбирают такую, которая по окраске больше всего соответствует испытуемой среде. По обозначению на этикетке стандарта узнают рН.

Электрометрическим методом рН определяют с помощью специальных приборов, к числу которых относится отечественный лабораторный ионометр ЭВ-74. Он состоит из металлического корпуса, где находятся элементы измерительной схемы прибора, а также лабораторного датчика, в комплект которого входят специальные электроды. Их погружают в испытуемый раствор и по шкале прибора определяют рН.

При приготовлении питательных сред приходится производить подщелачивание, так как мясная вода из свежего мяса имеет рН 6,6-6,8. Обнаружив в пробе кислую реакцию, берут новую пробную порцию среды, подщелачивают ее точным количеством децинормального раствора едкого натра или 10%-ного раствора углекислой соды и снова проверяют. После установления нужной реакции высчитывают, какое количество щелочи необходимо для подщелачивания всей среды. Чтобы избежать ошибок, добавлять щелочь следует осторожно; сначала ее берут в несколько меньшем количестве, затем еще раз определяют реакцию среды, после чего добавляют оставшуюся часть раствора щелочи.

При стерилизации сред под давлением рН может снижаться на 0,2-0,4. Поэтому после первого усреднения пробу рекомендуется прокипятить 30 с, а затем после охлаждения снова определить и установить нужный рН. Для определения рН в твердых средах их надо растопить и развести теплой дистиллированной водой.

Сухие питательные среды. В лабораторной практике широко используют готовые сухие питательные среды, выпускаемые промышленностью. Их растворяют в дистиллированной воде, разливают по пробиркам, колбам или бактериологическим: чашкам, и при необходимости стерилизуют в автоклаве или текучепаровом аппарате.

Розлив питательных сред. Среды по пробиркам и колбам разливают с помощью приспособления, состоящего из штатива и стеклянной воронки, на конце которой укреплена резиновая трубка со стеклянным наконечником. С этой же целью используют специальные дозирующие устройства — дозаторы.

Рис. 5. Схема устройства микроскопа: 1 — ножка микроскопа; 2 — макрометричсский винт; 3 — тубусодержатсль; 4 — окуляр; 5 — тубус; 6 — микрометрический винт; 7 — револьвер; 8 — предметный столик; 9 — конденсор; 10 — зеркало; 11 — объектив

Лабораторная аппаратура и правила пользования ею. Микроскоп и его устройство. Микроскоп — оптический прибор, с помощью которого рассматривают и изучают мельчайшие организмы и предметы, невидимые простым глазом. Микроскопы, производимые отечественной промышленностью для биологических исследований: биолам Р — микроскоп биологический рабочий с моно- или бинокулярной насадками, увеличение от 50 до 1800 раз; биолам Д — микроскоп биологический дорожный; биолам С — микроскоп биологический студенческий; люмам Р — рабочий и люмам И — исследовательский люминесцентные микроскопы.

Каждый микроскоп имеет две основные системы: механическую и оптическую (рис. 5). Механическая система микроскопа состоит из штатива, включающего ножку (1) и тубусодержатель (3) или колонку. К ней прикреплен тубус (5) с вращающимся барабаном-револьвером (7) на нижнем конце. Тубус передвигается макрометрическим винтом (2), для тонкой наводки служит микрометрический винт (б). К ножке прикреплен предметный столик (8), на который помещают исследуемый препарат, закрепляемый зажимами.

Оптическая система состоит из зеркала (10), конденсора (9) с ирисовой диафрагмой, объективов (11) и окуляра (4). Степень увеличения объективов указана на их оправе: х8, х10, х20, х40, х60, х90. Различают два типа объективов: сухие и иммерсионные (масляные). При работе с иммерсионными объективами каплю масла (кедрового, вазелинового или касторового) наносят на мазок и с помощью макрометрического винта осторожно под контролем глаза погружают объектив в масло, не прикасаясь к стеклу. Наблюдая в окуляр, медленно поднимают макровинтом тубус до появления изображения. Для тонкой наводки используют микрометрический винт. Окуляры отечественных микроскопов обозначаются 7х, 10х, 15х, 20х, т.е. цифрами, указывающими на степень их собственного увеличения. Умножив цифру на оправе объектива на цифру окуляра, получим число, показывающее, во сколько раз увеличивает микроскоп.

Перед работой с микроскопом надо установить освещение. При дневном свете пользуются плоским зеркалом, при искусственном — вогнутым. В качестве источников искусственного света используют лампы-осветители. Когда свет установлен, берут препарат, помещают на предметный столик и изучают сначала под малым, а затем под большим увеличением, используя для этого сухую или иммерсионную систему.

Рис. 6. Мазок из культуры листерий, окрашенный по методу люминесцирующих антител

Люминесцентные микроскопы используют для изучения объектов, обладающих собственным свечением, или объектов с вторичным свечением, возникающим после обработки их специальными красками — флуорохромами (акридин, аурамин, флуоресцеин и др.). Изучают также люминесцирующие антитела — специфические гамма-глобулины, выделенные из гипериммунных сывороток, соединенные с красителями. При окрашивании мазков такие меченые антитела адсорбируются на поверхности антигена (микробной клетки), что выявляется при исследовании в люминесцентном микроскопе в виде яркого свечения (рис. 6).

Кроме обычных световых микроскопов в научно-исследовательской работе и для диагностических целей применяют электронные микроскопы, в которых вместо световых лучей используют поток движущихся электронов.