Методы серийных разведений

Позволяют количественно оценить чувствительность выделенного микроба к антибактериальным средствам и определить МИК препарата. Методы серийных разведений основаны на прямом определении величины МИК.

Для определения величины МИК заданные концентрации антибиотиков вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают метод серийных разведений в бульоне, метод серийных разведений в агаре.

В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют также методы серийных макро – и микроразведений.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций антибиотиков или даже одной концентрации, соответствующих пороговым (то есть концентрациям, отделяющим чувствительные микроорганизмы от промежуточных и промежуточные от резистентных). Метод обеспечивает получение качественных результатов, позволяющих отнести исследуемый микроорганизм к определенной категории чувствительности, и часто используется в коммерческих тест-системах.

Метод серийного разведения антибиотика в питательной среде (бульоне).

Первоначально готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотиков в специальном растворителе. Из него готовят ряд убывающих разведений антибиотиков в пробирках с бульоном (чаще двухкратные) и добавляют испытуемую культуру (обычно 10⁵-10⁶ бактериальных клеток). Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотиков. Сроки инкубации зависят от вида микроорганизма (чаще сутки). Определяют МИК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (прозрачная питательная среда). Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) из нескольких последних пробирок с задержкой роста делают посев петлей на сектора чашки Петри. За МБК, которая, как правило, на несколько разведений меньше МИК, принимают концентрацию препарата в последней пробирке, посев из которой не дал роста.

Метод серийных разведений в плотной питательной среде.

Этот метод более чувствителен и точен, чем метод бумажных дисков. Каждый антибиотик испытывают, как правило, в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в чашки Петри. Контролем служит чашка с агаром без антибиотиков. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотиков 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста в термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет роста ни одной колонии.

Оценка результатов:

- чувствительные культуры – их рост подавлен всеми тремя концентрациями (можно применять антибиотики в средней терапевтической дозе);

- среднечувствительные (можно применять антибиотики только в увеличенной дозе) – рост подавляют вторая и третья концентрация антибиотиков;

- умеренно-устойчивые подавляет только третья наиболее высокая концентрация (антибиотики применяют только местно);

- устойчивые (антибиотики применять нельзя по тестам in vitro) - растут на всех трех концентрациях.

Ускоренные методы

Позволяют получить результат через 3-6 часов. При этом используют два основных принципа.

Первый принцип основан на ускоренном определении роста микроорганизмов по изменению окислительно-восстановительного потенциала (изменения рН определяют индикатором), продукции микроорганизмами биологически активных веществ (протеин А стафилококка, протеаз и др.). Чаще всего пользуются методом, основанным на изменении рН среды в процессе роста микроба в присутствии антибиотиков.

При использовании метода бумажных дисков или серийных разведений антибиотиков в агаре через 4-6 часов роста культуры поверхность чашки обрабатывают индикатором или вносят его в пробирки. В местах роста микроба среда окрашивается в красный цвет, при отсутствии роста микроба цвет среды не меняется. Учет и критерии оценки, как и при обычных методах.

На ускорении роста микроорганизмов с использованием специальных добавок к питательной среде основаны другие известные тесты. Разработаны автоматизированные тест-системы ускоренного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. В стрипы с критическими концентрациями препаратов (около 30 антибиотиков) вносят определенную концентрацию испытываемого штамма на специальной среде для роста микроорганизмов. После инкубации в течение 4-6 ч определяют прирост мутности раствора по сравнению с контрольными на автоматическом анализаторе или визуально.