Хроматографические параметры

Хроматограммы бывают дифференциальные, показывающие мгновенное значение какого-либо свойства потока подвижной фазы в определенный момент времени, и интегральные, показывающие суммарное значение того же свойства подвижной фазы за определенный промежуток времени.

На рис. 5.2 показана дифференциальная хроматограмма смеси двух веществ R₁ и R₂. Сорбционную способность хроматографируемого вещества характеризуют временем удерживания t _R или объемом удерживания V _R. Временем (объемом) удерживания называют время (объем элюента) от момента ввода пробы до момента выхода из колонки вещества с максимальной концентрацией (на хроматограмме – расстояния до максимума пика).

Вместо времени удерживания иногда употребляют равнозначное понятие – время выхода компонента. Удерживаемый объем элюента вычисляют по формуле:

V _R= t _R W,

где W – объемная скорость подвижной фазы.

Время (объем) удерживания t _R(V _R) хроматографируемого вещества складывается из времени (объема) пребывания вещества в подвижной фазе t ₀(V ₀) и времени(объема) пребывания вещества в неподвижной фазе (), т.е.

t _R= t ₀+ и V _R= V ₀+ . (5.1)

Время () называют приведенным временем (объемом) удерживания.

Сигнал

ввод пробы

V, t

μ

μ 0.5

t 0

V 0

h

Рисунок 5.2 – Дифференциальная хроматограмма: t (V) – время (объем) элюирования; 1 – нулевая линия; 2 – пик несорбирующегося вещества; 3 и 4 – пики разделяемых (определяемых) веществ R₁ и R₂; μ – ширина пика; h – высота пика; t ₀ – время выходя индифферентного (несорбирующегося) компонента; () и () – время (объем) удерживания компонентов R₁ и R₂, соответственно

 

В плоскостном варианте хроматографии (рис. 5.3) в качестве характеристики удерживания используют относительную скорость передвижения хроматографической зоны R_f, определяемую, отношением расстояния l, пройденным центром хроматографической зоны, к расстоянию L, пройденным фронтом подвижной фазы за один и тот же промежуток времени, т.е.

 

R_f = l / L. (5.2)

 

При постоянных условиях хроматографирования значения t _R, V _R и R_f строго воспроизводимы и могут быть использованы для идентификации веществ. Массу вещества, вымываемого из колонки с сорбентом, можно найти по площади под кривой элюирования (под пиком на хроматограмме):

,

где с – концентрация, моль×л^–1; V – объем, мл.

 

Фронт

Старт

l 1

Δ l

l 2

L

Рисунок 5.3 – Схема тонкослойной (бумажной) хроматограммы: l ₁ и l ₂ – путь, пройденный зонами разделяемых компонентов R₁ и R₂; Δ l – разрешение хроматографических зон; L – путь, пройденный фронтом проявителя за тот же промежуток времени

 

Распределение компонентов между фазами характеризуют коэффициентом распределения D:

 

D = с _Н/ с _П, (5.3)

где с _Н и с _П – общие аналитические концентрации всех форм хроматографируемого вещества в неподвижной и подвижной фазах, соответственно. Чем меньше коэффициент распределения компонента, тем быстрее он будет перемещаться по колонке.

Приведенный объем удерживания вещества связан с коэффициентом распределения и объемом неподвижной фазы соотношением:

 

,

 

где V _Н – объем неподвижной фазы.

Для характеристики полноты разделения компонентов R₁ и R₂ используют коэффициент селективности α:

 

. (5.4)

Разделение тем эффективнее, чем больше коэффициент селективности. Эффективность разделения двух соседних по времени удерживания компонентов на хроматограмме характеризуется разрешением пиков R_S, которое описывается уравнением:

 

, (5.5)

где μ ₁ и μ ₂ – ширина пиков, измеренная у их основания.

При хроматографировании одновременно происходит разделение веществ и размывание зон на сорбенте и пиков на хроматограмме – это является проблемой при хроматографировании не очень маленьких содержаний веществ.

Теоретический подход, объясняющий разделение смеси при хроматографировании, основан на изучении изотерм адсорбции – графических зависимостей концентрации вещества в неподвижной фазе с_S от его концентрации в подвижной фазе с_m при постоянной температуре. В соответствии с законом Генри угол наклона изотермы в координатах с_S = f (с_m) определяется коэффициентом распределения D = dс_S / dс_m. При малых концентрациях изотерма линейна (D =const), зона симметрична и концентрация вещества в центре зоны максимальна. Получаемый пик на хроматограмме тоже симметричен. Однако, это идеальный случай, который редко наблюдается на практике. При увеличении концентрации вещества в подвижной фазе линейный характер изотерм сохраняется только на начальных участках, затем коэффициент распределения меняется и это неизбежно приводит к размыванию хроматографических зон и пиков на хроматограмме, что свидетельствует об ухудшении разделения.

Ассиметрия хроматографических пиков значительно усложняет количественную обработку хроматограмм.

Поэтому на практике хроматографирование проводят только при таких условиях (малые концентрации), где изотермы являются линейными и величина коэффициента распределения не меняется в течение всего процесса.

Для описания процесса хроматографии и эффективности его проведения предложено ряд теорий, наиболее распространенной из которых является теория теоретических тарелок.

Эта теория основана на ряде допущений, основным из которых является представление адсорбционного слоя из ряда равновесных зон – теоретических тарелок (однако, такое представление носит чисто умозрительный и формальный характер, так как хроматографический процесс непрерывен и неравновесен). Равновесие считается достигнутым до того, как вещество переместится на следующую тарелку. При поступлении следующей порции подвижной фазы вещество перераспределяется, большая часть его переходит на следующую тарелку, а часть остается на предыдущей и т.д. В результате такого перемещения вещество размывается по нескольким тарелкам. Эта теория позволяет описать движение зоны в слое неподвижной фазы и оценить эффективность колонки. Количественной мерой эффективности хроматографической колонки служит высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ) Н и число теоретических тарелок N:

 

N = L / H,

 

где L – длина колонки (слоя сорбента).

Чем меньше Н и больше N, тем эффективнее хроматографическая колонка. Число теоретических тарелок легко рассчитать непосредственно из хроматограммы, сравнивая ширину пика μ и время пребывания компонента в колонке t _R:

или .

 

Теория теоретических тарелок дает возможность сравнить эффективность различных колонок, оценить качество сорбента и заполнения колонки. К сожалению, она не может дать практических рекомендаций, позволяющих избежать размывания хроматографических зон, кроме общего вывода: чем больше диаметр частиц сорбента, тем больше ВЭТТ, тем сильнее происходит размывание хроматографических зон.

Согласно кинетической теории размывание хроматографических зон и пиков на хроматограмме обусловлено неравномерностью движения потока подвижной фазы, молекулярной диффузией молекул в области зон с меньшей концентрацией сорбата и неравновесностью процесса хроматографии. Датскими учеными предложены эмпирические уравнения, позволяющие в какой-то степени нивелировать влияние этих негативных факторов.

 

Получение и анализ хроматограмм

 

Хроматограммы разделяемых смесей получают с помощью специального прибора – хроматографа, принципиальная блок-схема которого приведена на рис. 5.4. Основной узел хроматографа – хроматографическая колонка; на состав выходящего из нее элюата реагирует детектор – хроматографический датчик, который фиксирует изменение какого-либо свойства выходящей из колонки смеси, преобразуя его в электрический сигнал. Регистрирующее устройство (самописец) измеряет величину сигнала на диаграмной ленте или измеряемые параметры поступают на дисплей компьютера.

Рисунок 5.4 – Принципиальная блок-схема хроматографа: 1 – устройство ввода подвижной фазы; 2 – дозатор для ввода анализируемой смеси; 3 – хроматографическая колонка; 4 – детектор; 5 – регистрирующее устройство; 6, 7 – термостатируемые зоны

 

В хроматографах применяются различные детекторы, наиболее распространенными в газовой хроматографии являются универсальные детекторы по теплопроводности (катарометры) и пламенно-ионизационные. В жидкостной хроматографии чаще используют спектрофотометрические, люминесцентные и электрохимические детекторы.

Хроматография позволяет не только разделять компоненты смеси, но и определять ее качественный и количественный состав. Природу вещества характеризует положение пика на хроматограмме, т.е. время (объем) удерживания, а его массовое содержание – площадь, ограниченная контуром пика и нулевой линией фона детектора.

 

Качественный анализ

Идентификацию веществ хроматографическим методом проводят путем сравнения параметров удерживания (t _R, или V _R, ) анализируемых и известных индивидуальных веществ, полученных при одинаковых условиях. В некоторых случаях, когда нет гарантии о неизменности параметров удерживания компонентов анализируемой смеси и индивидуальных веществ, сравнивают относительные параметры удерживания или , которые практически не зависят от скорости элюирования.

 

Количественный анализ

При количественных определениях обычно используют два метода – метод нормировки и метод внешних стандартов.

Метод нормировки применяют для определения относительного содержания каждого из компонентов анализируемой смеси. Для этого измеряют площадь под пиком каждого из компонентов и по отношению этой площади к сумме площадей под всеми пиками на хроматограмме находят неизвестное относительное содержание каждого компонента:

 

(5.6)

Если чувствительность детектора различна по отношению к компонентам смеси, то используют поправочные коэффициенты f_i, учитывающие чувствительность детектора к каждому компоненту. И тогда

(5.7)

Поправочные коэффициенты f_i получают при анализе стандартных серий и рассчитывают по формуле:

 

,

 

где S_x, S _ст – площади пиков определяемого и стандартного вещества, соответственно; с_х, с _ст – концентрации определяемого и стандартного вещества, соответственно; f_x, f _ст – поправочные коэффициенты определяемого и стандартного вещества, соответственно.

Метод внешних стандартов применяют для определения абсолютного содержания веществ в разделяемой смеси. Приготавливают два (или больше) раствора определяемого компонента с различной, но известной концентрацией с₁ и с₂. Затем вводят в хроматограф строго одинаковые объемы этих стандартов и пробы.

 

Площадь пика

с, %

а)

б)

S 2

Sx

S 1

S 2

Sx

S 1

сx

 

Рисунок 5.5 – Хроматограмма (а) и градуировочный график для определения аналитов методом внешних стандартов (б): S ₁, S ₂ и S_х – площади пиков на хроматограмме внешних стандартов и анализируемой пробы, соответственно; с ₁, с ₂ и с_х – концентрации аналитов в стандартах и в анализируемой пробе, соответственно

На полученных хроматограммах измеряют площади пиков и одним из способов находят неизвестную концентрацию аналита с_х, например, по градуировочному графику (рис.5.5) или методом сравнения площадей пиков:

 

, (5.8)

 

где S_x, S ₁ и S ₂ – площади пиков аналита и стандартов, соответственно.