Тема 3. Типы оптических микроскопов

Оптический микроскоп проходящего света

В этом микроскопе свет источника сначала проходит через образец, а затем попадает в объектив. Существует два типа микроскопов проходящего света. В микроскопах светлого поля в отсутствие образца поле зрения яркое. Из образца свет сразу попадает в объектив. Точки образца, где свет поглощается или рассеивается, выглядят более темными. В микроскопах темного поля освещение боковое, и в отсутствие образца свет в объектив не попадает, как показано на рис. 4.1. Когда свет, рассеянный некоторой точкой образца попадает в объектив, она выглядит яркой на темном фоне. Некоторые объективы имеют встроенную ирисовую диафрагму, которую можно частично закрыть. В этом случае числовая апертура равна меньшему (из двух) значений, написанных на корпусе.

 

Рис. 4.1Часто объекты лучше рассматривать в темном поле. В этом режиме работы в центре оптической системы за конденсором устанавливают диск небольшого диаметра, не пропускающий свет, идущий непосредственно от источника. В объектив попадает лишь свет, рассеянный объектом.

Диафрагма позволяет поддерживать на одном уровне фоновую освещенность темного поля. В светлополь­ном режиме работы ирисовая диафрагма полностью открыта. В материаловеде­нии светлое поле можно использовать только в специальных случаях, например, при изучении тонких прозрачных пленок.

 

Оптический микроскоп отраженного света

Существуют микроскопы отраженного света двух типов. В первом для увеличения используют отражающие поверхности, как показано на рис. 1.56. Для увеличения в них используются сферические зеркала, а в тех случаях, когда не удается обойтись без линз, их изготавливают из материалов типа кварца, имеющих низкое поглощение света в интересующих интервалах длин волн.

 

Рис. 4.2 Микроскоп, использующий только отражающие оптические поверхности.

 

Такие микроскопы встречаются не слишком часто, но их можно использовать в диапазонах сильного поглощения света стеклом. В частности, в ультрафиолетовом и инфракрасном свете.

Микроскопы второго типа используют обычные линзы. Они в научно-исследовательских лабораториях используются очень широко. В настоящее время эти микроскопы имеют базовую конструкцию, позволяющую использовать специальные модули для работы в режимах темного поля, флуоресцентного света, интерференции, фазового контраста, суммирования сигнала и т.д.. Некоторые из них подробно рассмотрены ниже.

Микроскоп, основанный на отражении от сферических поверхностей, особенно хорош для работы в широком диапазоне длин волны. Другим достоинством микроскопов на основе отражающей оптики является очень большое рабочее расстояние объектива. Примером такого микроскопа, часто используемого материаловедами, является NikonOptiphot. В этом микроскопе объектив действует подобно конденсору. Он имеет возможность регулировки уровня осве­щения, что позволяет изменять яркость изображения образца. Недостатком таких микроскопов является невысокий контраст изображения. Как следствие, биологам приходится окрашивать образцы.

Флуоресцентный микроскоп

Для использования флуоресцентного микроскопа обязательно должны выполняться два условия:

1. Образец должен освещаться светом, возбуждающим флуоресцентное свечение материала.

2. Длина волны возбуждающего света должна быть короче флуоресцентного излучения, создающего изображение (из-за стоксовского смещения).

Для выделения флуоресцентного свечения необходимо использовать высококачественные оптические светофильтры. Во флуоресцентной микроскопии это является обязательным условием. Схема такого микроскопа приведена на рис. 1.57а. Принципы создания оптических светофильтров были описаны выше. Обра­тим внимание, что интенсивность флуоресцентного свечения чрезвычайно мала по сравнению с возбуждающим светом, и для улучшения отношения сигнал/шум возбуждающий свет должен быть полностью устранен. Раньше во флуоресцент­ных микроскопах с этой целью использовали метод темного поля. Для возбужде­ния флуоресценции необходим мощный источник света в диапазоне, близком к ультрафиолетовому диапазону. Поэтому источником света в таких микроскопах является ртутная, галогеновая или ксеноновая лампа. В самых последних моде­лях флуоресцентных микроскопов (рис. 1.57Ь) используют принцип освещения по Келеру.

При работе с ультрафиолетом требуется проявлять осторожность. Оптические элементы в этом случае должны пропускать ультрафиолет (и не должны обладать собственной флуоресценцией). Типичной иммерсионной жидкостью является глицерин из-за меньшей по сравнению с маслом флуоресценцией¹. Другой про­блемой флуоресцентной микроскопии является эффект фотоотбеливания, состо­ящий в постепенном снижении интенсивности излучения при больших временах облучения. Чтобы избежать чрезмерного облучения образца ультрафиолетом, ис­точник возбуждающего света имеет заглушку или нейтральный фильтр, снижаю­щий дозу облучения.

 

 

Рис. 4.3 а) — Принцип работы флуоресцентного микроскопа. Излучение широко­полосного источника света попадает на фильтр, который пропускает узкий диапазон длин волн в синей части спектра. Запирающий фильтр отделяет длинноволновое флуоресцентное излучение от коротковолнового возбуж­дающего света; (b) — схема типичного флуоресцентного микроскопа