Методы контрастирования в микроскопах проходящего света

Для распознавания объектов методом компьютерной микроскопии необходимо, чтобы составляющие его элементы отличались от фона или от других элементов по яркости, цвету или в текстуре. Основным методом наблюдения и исследования с помощью микроскопа проходящего света является метод светлого поля, который хорош для наблюдения контрастных и окрашенных объектов. Для реализации это метода необходимо иметь:

— собственно микроскоп проходящего света;

— объективы светлого поля (также могут быть использованы спе­циальные объективы — фазовые, поляризационные, безрефлексные, люминесцентные);

— конденсор (также могут быть использованы универсальный кон­денсор, если в нем есть свободное гнездо светлого поля «СП»/«Н», и поляризационный конденсор);

— осветитель (встроенный).

При необходимости исследовать малоконтрастные объекты, которые невозможно покрасить по тем или иным причинам, используются следу­ющие методы микроскопического контрастирования изображений.

Метод темного поля. Метод основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света, внутренняя апертура кото­рого должна превосходить числовую апертуру применяемого объектива. Таким образом, ни один прямой луч не попадает в объектив.

Рис. 3.2. Изображение, полученное в проходящем свете с помощью метода темного поля

При отсутствии объекта поле будет темным. При наличии — будет наблюдаться яркое блестящее свечение контура вокруг объекта на темном фоне в отраженном или рассеянном (диффузно отраженном) свете (рис. 3.2).

Для создания темного поля в микроскопе проходящего света применяют:

— щелевой метод;

— упрощенный метод, связанный с одновременным диафрагмиро­ванием осветительной апертуры конденсора и выходной апертуры объ­ектива, при этом объектив должен иметь ирисовую диафрагму или вкла­дыш, которые позволяют уменьшать выходное отверстие объектива;

— специальный конденсор темного поля.

При работе с иммерсионными объективами для уменьшения апер­туры объектива внутрь него вкладывается специальная диафрагма, имеющаяся обычно в наборе конденсора темного поля.

Если объектив имеет ирисовую диафрагму внутри объектива (кольцо с накаткой и маркировка на корпусе объектива), то, вращая кольцо, мож­но достичь необходимого перекрытия непрозрачным диском выходного зрачка. При смене объектива конденсор дополнительно настраивают центрировочными винтами, выставляя непрозрачный диск концент- рично относительно выходного зрачка объектива.

Можно получить эффект темного поля с помощью обычного конденсора. Для этого необходимо в плоскость апертурной диафрагмы конденсора (или в откидное гнездо под конденсором) установить пластину с непрозрачным диском. Однако следует помнить, что для каждого объектива этот диск может быть разным из-за величины выходного зрачка объектива. Специальный конденсор фазово-контрастного устройства имеет в одном из гнезд диафрагму темного поля.

Метод применяется для наблюдения живых клеток, микроорганизмов, прозрачных кристаллов и др. элементов, там где достаточно наблюдать контур.

Метод фазового контраста. В отличие от метода темного поля, вы­являющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта (рис. 3.3). Отличительной особенностью в изображении является наличие галла эффекта по контуру объекта (небольшое просветленное поле вокруг объекта).

Фазово-контрастное устройство дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект в амплитудные. В результате этого прозрачные объекты становятся видимыми.

Рис. 3.3 Изображения, полученные с помощью метода фазового контраста

 

Метод может быть реализован двумя способами:

— расположение элементов с фазовым и световым кольцами внутри оптических систем объектива и конденсора, соответственно. Этот способ реализуется с помощью фазово-контрастных устройств, которые комплектуются фазовыми объективами и специальным конденсором с набором световых колец (установленных в револьверное устройс­тво конденсора) или обычным конденсором, который комплектуется вкладышем со световым кольцом для одного или нескольких фазовых объективов. В этом случае фазово-контрастное устройство покупается отдельно от микроскопа.

— расположение элементов с фазовым и световым кольцами вне объектива и конденсора, т. е. в вынесенных плоскостях, внутри самого микроскопа. Этот способ реализуется с помощью соответствующих вкладышей, которые устанавливаются в плоскости апертурной диафраг­мы конденсора и вынесенной плоскости выходного зрачка объектива. При этом и конденсор, и объектив обычные.

Чаще всего смешанный способ реализуется в инвертированных микроскопах. Фазовые объективы имеют внутри фазовый элемент (линза или пластина) с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца в среднем составляет 1/2...2/3 от выходного зрачка объектива, при этом светопро- пускание кольца составляет 10—30 % в зависимости от типа фазового контраста. Таким образом, фазовое кольцо, нанесенное внутри объектива, выполняет две функции: гасит, как серый светофильтр, сильныйпрямой кольцевой свет из конденсора и придает этому свету постоянное фазовое смещение.

В зависимости от размера фазовых колец и способа их получения, различают:

— положительный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объ­ективе технологически получается путем травления, что вносит «опе­режение» в прямо прошедший свет, при этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светлом фоне (КФ-4, КФ-4М);

— отрицательный фазовый контраст (аноптральный или темно­польный фазовый контраст), когда фазовое кольцо в объективе техно­логически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки, что вносит «запаздывание» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона (МФА-2).

VARIEL-контраст (переменный контраст). Для работы с тканями и живыми клетками фирмой «Карл Цейсс» разработан новый метод конт­растирования, при котором объект с помощью одного устройства может последовательно наблюдаться в фазовом контрасте, косом освещении и темном поле (рис. 3.4).

При этом в конденсоре применяется диафрагма в форме кольцевого сектора, создающее одностороннее наклонное освещение. В объективе имеется как фазовое кольцо, так и кольцо для VARIEL-контраста. При перемещении диафрагмы конденсора в радиальном направлении извне внутрь устанавливается последовательно одностороннее темноеполе — VARIEL-контраст, как наложение фазового контраста и косого освещения.

Метод применяется в прямом микроскопе Axioskop40 и в инверти­рованном микроскопе Axiovert40С/200.

Метод поляризации. Поляризованный свет в проходящем свете для биологических объектов применяется, в основном, для волокон, сосудов, кристаллов сахара. Наблюдение производится на всех биоло­гических микроскопах при наличии анализатора и поляризатора, а для цветной картины используется λ-компенсатор (рис. 3.5).

Рис. 3.5. Метод поляризации

Метод люминесценции. Метод основан на наблюдении микро­скопических объектов с использованием их способности к свечению. По сравнению с методами обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ: цветное свечение, вы­сокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне, возможность исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов, а также различных жизненных процессов в динамике их раз­вития, обнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.

В медицинской микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител. Флуорохромы — красители, не вызывающие сильной окраски объектов в обычном свете, но флуоресцирующие при облучении уль­трафиолетовыми лучами. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов.

Метод флуорохромирования почти не отличается от общеизвестных методов окрашивания анилиновыми красителями, хотя и требуетменьше времени (доли минуты). В бактериологии этот метод применя­ется как метод люминесцентного выявления возбудителя туберкулеза, для диагностики таких инфекционных форм, как дифтерия, гонорея, возвратный тиф и др.

Фотолюминесценция представляет собой явление свечения объ­ектов, которое возникает в результате поглощения объектом лучистой энергии. Вследствие некоторых причин, свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами (300—400 нм), либо сине-фиолетовыми. В обоих случаях возникает свечение в цветовой гамме всего (или большей части) видимого спектра.

Этот вид люминесценции носит название наведенной (вторичной), в отличие от первичной — собственной флюоресценции, нередко про­являемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, некоторыми продуктами нормального и патологического обмена.