Современные представления о нормофлоре как базовый вектор выбора пробиотических культур для ПФП

Подсчитано, что в кишечном тракте взрослого человека обнаружено 17 различных семейств, 45 родов, свыше 500 видов микроорганизмов, их количество составляет 10¹³, что на порядок выше общей численности клеточного состава человеческого организма [506, 565, 693].

В кишечнике млекопитающих и птиц обитает более 400 видов [581, 624] различных микроорганизмов, которые выполняют различные функции. По численности и физиологической значимости преобладают бифидо- и лактобактерии. Лактобактерии являются факультативными анаэробами, бифидобактерии – анаэробами (размножаются без доступа кислорода).

Пищеварительный тракт представляет собой микробиоценоз, обеспечивающий защиту и развитие организма. С первых минут жизни в желудочно-кишечный тракт поступает множество разнообразных групп микроорганизмов, однако не все они приживаются в кишечнике. В процессе эволюционного развития сформировался определенный микробиоценоз ки-шечника, обусловленный постоянной нормальной, или резидентной, микрофлорой. Нормальной следует считать эволюционно сложившуюся микрофлору, которая формировалась во взаимодействии с организмом че-ловека (или животного) в течение основного периода его существования как биологического вида [114, 115].

До настоящего времени нет общепринятой классификации нормальной микрофлоры [317, 359, 541, 647], однако чаще всего принято подразделять нормальную микрофлору кишечника здоровых людей и животных на три группы:

- индигеная (постоянная, резидентная), которая, колонизуя поверхность клеток слизистой, примыкает к мембранам энтероцитов, или локализована в непосредственной близости от поверхности эпителия, в слое муцина, прилежащего к клеткам ворсин в нижних отделах тонкого и толстого кишечника и образует биопленку, покрывающую мембраны эпителиальных клеток. С учетом этого принципа микроорганизмы, ассоциированные со слизистой оболочкой, еще называют мукозной микрофлорой (М-флорой), т.е. обитающей в толще слоя муцина, покрывающего эпителий и составляющей микробно-тканевый комплекс кишечника МТКК, участвуя в примембранном пищеварении;

- аутохтонная микрофлора, которую составляют бактерии, локализующиеся в просвете кишечника, ее еще называют полостная (П-микрофлора); микроорганизмы аутохтонной микрофлоры в сотни раз менее устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов по сравнению с бактериями, находящимися в составе биопленки, но сравнительно более постоянны, чем аллохтонная микрофлора.

- аллохтонная (транзиторная или временная) (подробнее п. 1.7).

Нормофлору подразделяют так же на облигатную факультативную и условно патогенную. Количество и функции основных представителей нормофлоры приведены в табл. 1.3.

Биопленка индигенной микрофлоры имеет толщину от 0,1 до 0,5 мм. Биопленка представляет собой полисахаридный каркас, состоящий из микробных полисахаридов и муцина, который продуцируют клетки макроорганизма. В этом каркасе иммобилизованы микроколонии бактерий – представителей нормальной микрофлоры, которые могут располагаться в несколько слоев, верхние из которых сотавляют аутохонную микрофлору.

В состав нормальной микрофлоры входят как анаэробные, так и аэробные бактерии, соотношение которых в большинстве биоценозов составляет 10:1–100:1. Транзиторная микрофлора представлена сапрофитными условно патогенными микроорганизмами, которые обитают на коже или слизистых оболочках в течение нескольких часов, дней или недель, не вызывая заболеваний. Присутствие транзиторной микрофлоры определяется не только поступлением микроорганизмов из окружающей среды, но и состоянием иммунной системы организма хозяина и составом постоянной нормальной микрофлоры.

Все три группы бактерий кишечника вырабатывают в процессе своей жизнедеятельности целый ряд биологически активных веществ, играющих роль тонких регуляторов гомеостаза (подробнее в пп. 1.4.2).

Заселение бактериями различных областей тела начинается в момент рождения человека и продолжается на протяжении всей его жизни. Формирование качественного и количественного состава нормальной микрофлоры регулируется сложными антагонистическими и синергическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценозов.

Нормальная микрофлора характеризуется неоднородностью и отно-сительным постоянством в разных отделах желудочно-кишечного тракта. Б.В. Пинегин, В.П. Мальцев, В.М. Коршунов (1984); R. Selwood (1984) отмечают, что состав П- и М-микрофлоры пищеварительного тракта может существенно различаться по количественной и качественной ха-рактеристикам в зависимости от рациона питания и внешних воздействий.

Состав транзиторной микрофлоры может меняться в зависимости от:

• возраста,

• условий внешней среды, условий труда, рациона питания,

• перенесенных заболеваний, травм и стрессовых ситуаций.

Основная функция индигенной микрофлоры фомулируетя как поддержание колонизационной резистентности КР, обеспечение защиты кишечника от колонизации чужеродными микроорганизмами, и в частности, поддержание иммунокомпетентных клеток слизистой оболочки толстой кишки, что обеспечивает более быстрый ответ на инфекцию [275]. Термин КР впервые введен Van der Waaij D., под ним понимают совокупность взаимосвязанных физиологических, микробиологических и иммуно-логических факторов организма, препятствующих колонизации организма патогенами [101, 541]. КР обеспечивается за счет нормальной пери-стальтики кишечника, препятствующей избыточной колонизации тонкой кишки, конкуренции за места адгезии, подавления адгезии условно патогенных бактерий, ингибирования транслокации, за счет продукции антибиотических веществ и ряда опосредованных механизмов.

В последние годы в экспериментах установлена способность нормофлоры снижать концентрацию холестерина в крови, липидов в сыворотке крови, что способствует профилактике атеросклероза. Связывание микробными метаболитами пробиотиков азота имеет значение в предупреждении печеночной энцефалопатии, фосфатов – риска развития хронической почечной недостаточности, а гидролиз производных ща-велевой кислоты (оксалатов) защищает от образования почечных камней. Известна способность молочнокислых бактерий инактивировать гистамин, что снижает проявление аллергии. У лиц с гипертонией, получавших йогурт, сквашенный лактобациллами, продемонстрировано снижение повышенного кровяного давления.

Пробиотическая микрофлора образует биологически активные соединения – летучие или короткоцепочечные жирные кислоты, участву-ющие в регуляции абсорбции ионов натрия, калия, хлора и воды, а также кальция, магния и цинка, поддерживающих водный, электролитный и кислотно-щелочной баланс в организме.

Бактерии синтезируют также витамины К, В₁ – тиамин, В₂ – рибофлавин, В₃ – никотиновую кислоту, В₆ – пиридоксин, В₁₂ – цианко-баламин, пантотеновую и фолиевую кислоты.

По мнению Р.В. Веселухина (1971), И. Жуковой (1966), участие сим-бионтных микроорганизмов в азотистом (белковом) питании является одной из основных их функций.

В результате сложных биохимических процессов, протекающих в желудочно-кишечном тракте хозяина, микроорганизмы, усваивая по-ступающие питательные вещества, размножаются, растут и быстро уве-личивают свою биомассу.

Отмирая, они перевариваются и усваиваются организмом, являясь источником белка.

Лактобациллы широко применяются в гастроэнтерологической практике, так как:

ü ·предотвращают развитие колита, в том числе язвенного (снижают активность фермента миелопероксидазы);

ü ·колонизируют защитный покров слизистой, не проникая в крипты (применяют при неспецифическом язвенном колите);

ü ·оказывают ингибирующее действие на Helicobacter pylori.

В последнее время появились данные о противоопухолевой активности лактобактерий, механизм которой связан с действием бактериоцинов (гл. 1.4.2.):

- L. аcidophilus обладают выраженной противоопухолевой активностью в отношении злокачественных новообразований в кишечнике;

- L. casei обладают наиболее высокой противоопухолевой активностью в отношении сарком. Назначение 58 больным с раком мочевого пузыря L. casei в течение года снизило в 1,8 раз риск рецидива.

 

Таблица 1.3 – Количественное содержание и функции представителей микробиоценоза кишечника [211]

Наименование микроорганизма	Количество микроорганизмов в одном г фекалий	Функция микроорганизма
человека	мышей
Облигатная микрофлора	Bifidobacterium (большинство Bifidum)	109 – 1010	109 – 1010	Физиологическая защита кишечного барьера от проникновения микробов и токсинов внутрь организма; выработка жирных кислот; активация пристеночного пищеварения; синтез АК, витаминов; усиление всасывания ионов металлов и вит.D; иммуномодулирующее действие; препятствуют деградации sIgA, стимулируют интерферонообразование и вырабатывают лизоцим
Lactobacterium sp.	106 – 108	109	Продуцируют молочную кислоту, перекись водорода, пируват, ацетат, пропионовую кислоту, манитол, низин; высокая антагонистическая активность против протея; иммуномодуляция – стимуляция фагоцитарной активности нейтрофилов, макрофагов, синтеза иммуноглобулинов, образование интерферонов, ИЛ-1, фактора опухоли α; рециркуляция желчных кислот и холестерина; сохранение баланса состава микробных популяций после приема антибиотиков
Propionobacterium acnes	106 – 107	нд	Нормальные кислотообразователи, обладают антагонистическим действием в отношении патогенов
Escherichia coli	107 – 108		С нормальной ферментативной активностью	Стимулируют антителообразование и оказывают иммуномоделирующее действие; способствуют гидролизу лактозы; синтез витаминов (особенно вит.К) вырабатывают колицины; способстуют активации гуморального и местного иммунитета; пристеночно расположенные E. coli характеризуются низкой метаболической активностью, что делает их менее уязвимыми к действию ряда антибиотиков
106 – 107	106 – 107	Со сниженной ферментативной активностью
106 – 107		Лактозонегативные
Enterococcus sp	105 – 106	105 – 106	Общее их количество не должно превышать число кишечных палочек. Обладают антогонистической активностью в отношении патогенных микроорганизмов
Факультативная и условно патогенная микрофлора	Streptococcus sp	105 – 106		Пептострептококки – образуют водород, превращающийся в перекись, тем самым поддерживают кислый рН, участвуют в протеолизе белков молока, ферментации углеводов. Непатогенные стрептококки способствуют выработке Ig.
Bacteroides	107 – 1011	107 – 108	Расщепляют желчные кислоты, участвуют в процессе липидного обмена
Peptococcus	105 – 106		Метаболизируют пептон и АК с образованием жирных кислот, вырабатывают широкий спектр органических кислот
Staphylococcus	<104	104
Bacillus	105 – 106	103	Антатогистическая активность к широкому спектру патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, высокая ферментативная активность, противоаллергенное и антитоксическое действие
Дрожжеподобные грибы	<104	106
Proteus	<104	104
Klebsiella, Serratia, Citrobacter etc.	<105
Fusobacterium, eubacterium, cathenobacterium etc.	<104		Участвуют в синтезе пептидаз, расщепляющих короткие пептиды до АК

 

Лактобациллы обладают свойствами адгезии к энтероцитам и уротелию, благодаря чему они особенно важны при патологии желудочно-кишечного и урогенитального тракта. Карбогидратные группы, распо-ложенные на поверхности бактериальной клетки, усиливают адгезию ионов кальция, норализуют рН среды. Существуют убедительные данные, что некоторые виды лактобацилл уменьшают риск камнеобразования в почках, обладая оксалатмодифицирующей активностью. Доказано, что снижают экскрецию оксалатов с мочой L. аcidophilus, L. plantarum, L. casei, L. delbrueckii, L. fermentum, L. helveticus, а L. plantarum уменьшают объем оксалатных камней в анаэробных условиях на 30–70% [502].

Таким образом, интегрально все представители симбиотической нормальной микрофлоры выполняют следующие функции [441, 500, 710]: совместно со слизистой оболочкой кишечника служат барьером от проникновения микробов и токсинов во внутреннюю среду организма; обеспечивают организм хозяина некоторыми питательными веществами, включая короткоцепочные жирные кислоты, а также витаминами К и группы В, аминокислоты образуют биологически активные вещества, определяющие высокую антагонистическую активность резидентных представителей нормофлоры по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам; участвуют в утилизации пищевых субстратов и ксенобиотиков; усиливают всасывание через стенки кишечника ионов кальция, железа; регулируют гуморальный и клеточный иммунитет, предупреждая многие заболевания и инфекции, представленные в табл. 1.4.

В качестве индигенных пробиотических микроорганизмов используют чаще культуры 3 родов: [539, 545, 574, 680] лактобациллы Lactobacillus (L. delbreuckii subsp. bulgaricus, L.plantarum, L. acidophilus, L.rhamnosus, L. fermentum L. аmylovorus, L. brevis, L. cellobiosus, L. lactis, L. reuteri) бифидобактерии Bifidobacterium (B.bifidum, B.longum, B.breve B. adolescentis, В. animalis, В. infantis, В. thermophilum и др.) и кишечную палочку E (E.coli). В функциональных кисломолочных продуктах видовой состав пробиотической микрофлоры ограничен лактобациллами, бифидо-бактериями, лактококками и термофильным стрептококком, ввиду того, что КГКП относятся к технически-вредной микрофлоре, способной вызвать пороки продуктов.

Таблица 1.4 – Оздоравливающие эффекты пробиотиков

1. Стимулирование иммунной системы	Стимулируют производство В-лимфоцитов, распознающих чужие микробы, а также фагоцитов, уничтожающих их. Повышают производство антител, действующих в качестве противоядия. Увеличивают численность цитокининов, объединяющих иммунную систему в единое целое; стимулируют выработку в организме альфа-, бета- и гамма-интерферона, ответственного за состояние иммунной системы и уничтожающего вирусы
2. Противоопухолевый эффект на толстую кишку	Антимутагенная активность; изменяют проканцерогенную активность колонизированных микробов; оказывают влияние на концентрацию желчных солей
3. Избыточный рост в тонких кишках	Лактобациллы влияют на активность избыточного роста через снижение количества токсических метаболитов и их антибактериальных характеристик
4. Заболевания сердца	Ассимиляция холестерола бактериальными клетками; антиокислительный эффект; изменяют гидролазную энзимную активность
5. Антигипертензивный эффект	Бактериальные пептидазы воздействуют на молочный протеин - результат антигипертензивных трипептидов; компоненты клеточной стенки действуют как АСЕ-ингибиторы
6. Урогенитальные инфекции	Адгезия к уринарному и вагинальному трактам; ингибируют Н202 продукции; восстановление нормальной микробной флоры
7. Инфекции, вызванные Helicobacter Pylori	Конкурентная колонизация, подавляют развитие Helicobacter Pylori
8. Аллергии	Предохраняют от транслокации антигенов в кровяном токе
9. Устойчивость к внутренним патогенам	Устойчивость к колонизации; создают неподходящие условия для патогенов (pH, бактериоцины)
10. Печеночная энцефалопатия	Ингибируют уреазо-продуцирующую флору;
11. Способствуют усвоению лактозы	Воздействует на лактозу в тонких кишках посредством бактериальной лактазы

 

Для разработки БП и ПФП используют и другие микроорганизмы. Впервые стрептококки применили в виде кислого молока или йогурта. До сих пор штамм S. salivarius subsp. Thermophilus (рис. 1.5) – основа для производства йогурта, является одной из наиболее известных пробиотических культур. Среди изолятов из кишечной микрофлоры применяют штаммы Streptococcus faecium. Два из них (М74 и SF68), выделенные из кишечника человека, широко используют в ветеринарии [677]. Некоторые БП и ПФП в своем составе содержат другие виды кокков – L.lactis sp. lactis (рис. 1.6), L. lactis sp. cremoris, L. lactis sp. diacetylactis [577], а также микроорганизмы родов Leuconostoc, Propionibacterium [15].

Р и с. 1.5. Streptococcus thermophilus [Food microbiology]	Р и с. 1.6. Lactococcus lactis sp. lactis ATTC 11454 [Visualphotos]

 

Лактококки, по требованиям к пробиотикам, не отвечают требованию способности приживания в кишечнике, но используются в составе ПБ и ПФП с пробиотиками в симбиозе с лактобациллами или бифидобактериями, т.к. способствуют лучшему росту и функционированию последних. Интерес по использованию лактококков, вырабатывающих бактериоцины, ис-пользуемых в составе функциональных продуктов, резко возрос [434] (подробнее п. 1.5).

Как показали практические наблюдения, пробиотические эффекты могут быть вызваны и некоторыми группами аллохтонных микро-организмов. Примером тому служит пробиотическое использование куль-туры дрожжей Saccharomyces boulardii, которые не являются нормофлорой желудочно-кишечного тракта человека, но вместе с тем способны пред-отвращать рецидив псевдомембранного колита, вызываемого Clostridium difficile.

Протеаза, секретируемая S. boulardii, разрушает токсин Cl. difficile, образуемый на поверхности эпителиальных клеток кишечника. Оказалось, что некоторые представители обширной группы спорообразующих бактерий – Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Sporolactobacillus своим при-сутствием способны предотвращать кишечные расстройства, и порой даже в большей степени, чем традиционные пробиотики на основе лакто- и бифидобактерий.

Вместе с тем спорообразующие бактерии в качестве пробиотиков применяются редко и с большими ограничениями, чем лакто- и бифидобактерии. Главными сдерживающими факторами является родство спорообразующих бактерий с патогенными и токсигенными видами, такими как Bacillus anthracis, Clostridium рerfringens, С. botulinum (подробнее п. 1.7).

Таким образом, имеющиеся сведения о микробной флоре кишечника [565] и опыт практического использования побиотиков, дают основания считать, что МТКК, совместно аллохтонными микроорганизми ЖКТ, является системой, сопоставимой по значимости с другими системами организма и обладает следующими важнейшими физиологическими функциями:

1. Морфокинетическая (трофическая): продукты метаболизма микробов служат источником питания эпителиоцитов и стимулируют моторику кишечника.

2. Защитная: обеспечение резистентности колонизации, формирование биопленки, предотвращающей адгезию инородных микробов, продукция лизоцима, органических и свободных желчных кислот, конкуренция за рецепторы и пищевые субстраты, увеличение скорости обновления клеток и др.

3. Пищеварительная: участие в метаболизме клетчатки и неусвоенных нутриентов.

4. Синтетическая: синтез холестерина, витаминов и других биологически активных веществ.

5. Иммуногенная: стимуляция синтеза иммуноглобулинов и иммунокомпетентных клеток.

6. Участие в патогенезе ряда патологических состояний и заболеваний (канцерогенез, ожирение, гиперхолестеринемия, артериальная гипертензия, аллергия, артриты, оксалатурия и мочекаменная болезнь, болезнь Альцгеймера и др.) [215].

Однако коммерческие продукты (это касается ПФП, БАД и БП), эффективность которых не доказана в исследованиях у человека (животных), не должны называться пробиотиками, несмотря на то, что они могут содержать «потенциально полезные культуры микроорганизмов» [ 11 ], т.е. термин «пробиотики» должен использоваться только для обозначения продукта или препарата, содержащего живые микроорганизмы в адекватном количестве, сохраняющемся на протяжении всего периода хранения и имеющего доказательства эффективности по результатам многочисленных контролируемых исследований у человека (животных).