Тема №12. Реакция агглютинации и ее модификации.

Цель занятия: изучить серологические реакции (реакцию агглютинации), технику выполнения и учет результатов

Материалы и оборудование: сыворотка крови, штатив с пробирками, спица, пластина для РА.

Сущность заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащие специфические антигену антитела, в равномерной взвеси клеток происходит склеивание, образование глыбок, комочков, которые постепенно оседают на дно пробирки, формируя характерный осадок – агглютинат, жидкость над ним просветляется. Если антигеном является взвесь неподвижных бактерий (без жгутиков), имеющих только соматический О-антиген, образуется мелкозернистый осадок в течение 16-22ч. Если антигеном служит взвесь бактерий, имеющих жгутики (подвижные виды), и в агглютинации участвует наряду с соматическим еще жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупнозернистый агглютинат.

В ветеринарной практике РА используют для диагностики бруцеллеза, сальмонеллеза, колибактериоза, листериоза, вибриоза, лептоспироза и других заболеваний. Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровяно-капельный, гемагглютинации (РГА), торможения гемагглютинации (РТГА), антиглобулиновый Кумбса, РА по Кастелани (метод адсорбции агглютининов), кольцевая проба с молоком.

Антигены поливалентны — имеют несколько детерминантных рецепторов для связи с антителами и способны вступать в реакцию с ними как в организме животного (in vivo), так и вне организма — в пробирке (in vitro).

Антитела — высокомолекулярные белки глобулиновой фракции сыворотки крови (иммуноглобулины). По проявлению феномена взаимодействия между антигеном и антителами in vitro различают: осадочные (прямые) реакции, лизирующие и нейтрализующие. Антитела, участвующие в осадочных реакциях, получили название по своему взаимодействию с антигеном: аглютинины—вызывают склеивание корпускулярного антигена — аглютиногена и осаждение комплекса антиген — антитело (агглютината); преципитины—образуют преципитат с растворимым антигеном — преципитиногеном.

Осадочные серологические реакции протекают в две фазы: первая фаза — специфическая, невидимая простым глазом, при ней происходит образование комплекса антиген — антитело, во второй фазе — неспецифической (физико-химической) — проявляется конечный эффект — видимый результат, осаждение агглютината.

В ветеринарной и медицинской практике серологические реакции как методы диагностики инфекционных болезней применяются для: 1) определения, выявления (качественное и количественное) антител в сыворотке животного с помощью заведомо известного антигена; 2) определения специфического антигена с использованием заведомо известных специфических гипериммунных сывороток (сибиреязвенная, сальмонеллезные, бруцеллезные и др.), установления видовой (вариантной) принадлежности возбудителя болезни, выделенного из исследуемого материала (серологическая идентификация).

Серологические реакции применяют также для оценки естественно и искусственно приобретенного организмом животного иммунитета. Серологические реакции ставят на физиологическом растворе NaCl потому, что вторая фаза их протекает в слабоэлектролитной среде.

Для определения антител в сыворотке крови (по известному антигену) сначала берут кровь (5— 10 мл) из яремной вены животного (у свиней из хвостовой) в стерильные пробирки и ставят в теплое место. После образования сгустка его осторожно отделяют от стенок пробирки, обводят стерильной металлической проволокой (можно вязальной спицей) и ставят в холодное место для ретракции. Сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, последние нумеруют и отправляют с нарочным и сопроводительным письмом в лабораторию. В РА (как и вообще при серологических исследованиях) используют или свежие сыворотки без гемолиза, или консервированные фенолом, мертиолатом, борной кислотой.

Антиген для РА представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых или живых бактерий. Для диагностических целей необходимо пользоваться стандартным антигеном. Если же требуется идентифицировать бактериальную культуру, выделенную из патологического материала, применяют стандартные сыворотки, а антиген готовят из суточной культуры — смыв с МПА.

Для каждой сыворотки нужна отдельная пипетка. В зависимости от вида диагностируемого заболевания готовят соответствующие степени разведения сывороток (согласно инструкции). Это объясняется различным содержанием в сыворотке нормальных антител (у разных видов животных). Удобно делать разведения следующим образом. В отдельной пробирке готовят исходное (основное) разведение сыворотки — 1:25, смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с 2,4 мл физиологического раствора. В опытные пробирки наливают по 1 мл физраствора NaCl. Затем из пробирки с основным разведением сыворотки 1 мл ее переносят в 1-ую опытную пробирку, а затем 1мл переносят во 2-ую пробирку (1:100), из второй — в 3-ю 1 мл и т. д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы в каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки. Во все пробирки добавляют по две капли стандартного антигена (концентрация 40 млрд. микробных тел в 1 мл), смешивают встряхиванием и выдерживают в термостате 4—6 ч (37°С), а затем при комнатной температуре 14—16 ч.

Техника постановки РА. 1) В штатив ставят 5 пробирок в ряд. Количество рядов зависит от количества проб сывороток, поступивших для исследования. Пробирки подписывают, (нумеруют) карандашом по стеклу. 2) Готовят основное разведение каждой испытуемой сыворотки, а также контрольных – позитивной и нормальной сывороток животных (например, КРС). Для этого в 1-ую пробирку ряда вносят 2,4 мл физраствора и добавляют 0,1 мл сыворотки (1:25). 3) Готовят рабочие разведения каждой пробы сыворотки: в 3-ю, 4-ю, 5-ю пробирки всех рядов вносят по 0,5 мл физраствора. Затем из первой пробирки мерной пипеткой (с помощью «груши») переносят во вторую и третью пробирки по 0,5 мл основного разведения сыворотки. В третьей пробирке внесенную сыворотку смешивают с находящимся в ней физраствором (получается разведение 1:50). Из третьей пробирки 0,5 мл сыворотки переносят в четвертую, смешивают (разведение становится 1:100) и 0,5 мл переносят в пятую пробирку (разведение 1:200). Из последней пробирки 0,5 мл разведенной сыворотки выливают в банку с дезраствором. Таким образом, во второй, третьей, четвертой и пятой пробирках осталось по 0,5 мл сыворотки крови, разведенной соответственно 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200, то есть получили последовательные двукратные разведения каждой пробы сыворотки. 4) В пробирки с разведенными сыворотками вносят антиген, предварительно разведенный физраствором NaCl до нужной концентрации (единый бруцеллезный антиген разводят 1:10— 1 млрд микробных тел в 1 мл), вносят его градуированной пипеткой в количестве 0,5 мл в каждую пробирку. В результате конечные разведения сыворотки становятся в 2 раза больше (концентрация в 2 раза меньше) — соответственно 4: 50,1: 100, 1: 200, 1: 400, а в каждой опытной пробирке общий объем компонентов составляет 1 мл. В первую пробирку антиген не добавляют, она служит контролем качества испытуемой сыворотки. Компоненты при постановке РА вносят в пробирки отдельными (индивидуальными) мерными пипетками (пользуясь резиновыми грушами) или групповыми дозаторами. После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена Штативы с пробирками осторожно встряхивают и помещают в термостат на 16—20 ч (37—38 °С), затем 1—2 ч выдерживают при комнатной температуре, после чего учитывают реакцию агглютинации.

Учет РА проводят невооруженным глазом (визуально) или с помощью агглютиноскопа в каждой пробирке, начиная с контрольных. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей в первой пробирке опытного ряда РА не учитывают. Результаты РА определяют в крестах по следующей схеме:

++++(#) — полное просветление жидкости над полностью осевшим на дно пробирки агглютина том в виде раскрытого перевернутого белого кружевного зонтика. При встряхивании зонтик раз­бивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной. Принято считать, что произошл 100 %-ная агглютинация

+++ (+++) — неполное просвещение жидкости, но хорошо выраженный зонтик (75 %-ная агглютинация). При встряхивании агглютинат разбивается на хлопья, комочки, глыбки; жидкость слегка мутноватая;

++ (два креста) — заметное просветление жидкости, зонтик умеренно выражен (50 %-ная агглютинация), при встряхивании осадок разбивается на более мелкие глыбки и комочки, жидкость мутная;

(+) — едва заметное просветление жидкости, зонтик слабо выражен, при встряхивании осадок разбивается на небольшое количество хлопьев и комочков (25 %-ная агглютинация), жидкость явно мутная;

— (минус) — просветление жидкости и образование зонтика отсутствуют, на дне пробирки в центре виден «пунктика или «пуговка» — компактный осадок клеток (микробов) антигена которые при встряхивании разбиваются в равномерную мутную взвесь.

Показатели агглютинации в пробирках на два, три или четыре креста характеризуются как положительная реакция. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация с оценками на два, три и четыре креста, считают ее титром. Диагностическую оценку реакции агглютинации проводят с учетом выраженности в крестах и по высоте ее титров (при различных болезнях по-разному).

В серологической диагностике имеются еще варианты постановки РА — реакция микроагглютинации, когда результат учитывают в раздавленной капле жидкости на предметном стекле под микроскопом. Каплю пипеткой берут из пробирки, в которой соединены сыворотка и антиген. Практическое применение эта реакция нашла в диагностике лептоспироза, сыворотку готовит биопромышленность. Выпускают ее в сухом (лиофилизированном) виде.

В ветеринарии реакция Кумбса разработана для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в виде бактериального варианта.

Методика постановки реакции Кумбса. Компоненты реакции; бруцеллезный антиген (отмытый физраствором 2—3-кратным центрифугированием), испытуемая сыворотка крупного рогатого скота, антиглобулиновая сыворотка. Предварительно ставят обычную РА в четырех разведениях исследуемой сыворотки 1:50—: 400. Учитывают результат, затем определяют предельный титр. Пробирку с сывороткой предельного титра отставляют, а содержимое следующих пробирок исследуют на наличие неполных антител: в эти пробирки добавляют по 2 мл физраствора, содержимое каждой пробирки переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют при 4000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспен-дируют. 2 мл физраствора вновь центрифугируют при тех же условиях. После второго отмывания и удаления надосадочной жидкости осадок ресуспендируют в 1 мл антиглобулиновой сыворотки (в рабочем титре), смесь помещают в термостат на 18 ч (37 °С), затем оставляют на 2—4 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результат, как при обычной РА. Минимальный рабочий титр реакции Кумбса при бруцеллезе крупного рогатого скота учитывается) 1:200, 1:100 считается сомнительным результатом.