Тема №7. Культуральный рост микроорганизмов. Рост аэробов.

Цель занятия: изучить характер роста микроорганизмов на питательных средах, выделять чистую культуру

Материалы: чашки Петри, линейка, увеличительное стекло, бактериальные петли, пастеровские пипетки.

Чистая культура – популяция микроорганизмов, принадлежащих одному виду.

Чистую культуру обычно получают путем пересева на стерильную питательную среду клеток, взятых из отдельно стоящей колонии бактерий.

Для успешного культивирования, помимо правильно подобранных сред (элективные питательные среды, стимулирующие развитие микроорганизмов) и правильно произведенного посева, необходимы оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение воздухом). Культивирование анаэробов сложнее, чем аэробов, для удаления воздуха из питательной среды используют различные способы. Выделение отдельных видов бактерий (чистой культуры) из исследуемого материала, содержащего, как правило, смесь различных микроорганизмов, является одним из этапов любого бактериологического исследования. Чистой культурой микробов получают из изолированной микробной колонии. Этапы выделения чистой культуры бактерий

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху) 3 пробирки, содержащие по 15 мл МПА, ставят в водяную баню для расплавления агара. После чего, остужают до 43-45°С. В 1 пробирку вносят петлю с исследуемой культурой. Затем прокаленной петлей содержимое 1-й пробирки во 2-ю и 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в чашки Петри обозначенные №, соответствующие № пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки ставят в термостат. Количество колоний уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Расплавленную пит.среду разливают в 3 чашки Петри. В 1-ю вносят каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность среды. Далее, не прожигая шпатель и не набирая нового материала, шпатель переносят во 2-ю и 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся в нем материал.

Техника посева аэробов и анаэробов одинакова; различия заключаются в условиях содержания посевов, составе питательных сред и аппаратуре для инкубирования. Процесс дыхания протекает по типу окислительной реакции. Для анаэробов кислород оказывает токсическое действие. Необходимую для жизни энергию анаэробы получают путем расщепления органических и неорганических соединений, входящих в состав питательные среды. Самым простым способом удаления растворенного кислорода является кипячение. Перед посевом пробирки с питательными средами кипятят в водяной бане 10-20 минут. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательной среды заливают сверху стерильным вазелином или парафиновым маслом (толщина 1-1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки. В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, ПВК. В жидкие питательные среды помещают пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Культуральные свойства микроорганизмов устанавливаются по морфологии колоний и особенности роста культуры на питательных средах. Биохимические признаки (свойства) бактерий определяются набором ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту.

Рост на плотных питательных средах.

Для получения свойств колоний культивируют на 1,5-2% МПА в чашках Петри. Если микробы не растут, пользуются специальными средами.

Колонии характеризуют по следующим признакам: форме, прозрачности, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре, консистенции.

Величина определяется диаметром. Точечные (менее 1мм), мелкие (1-2 мм), средние (2-4 мм), крупные (4-6 мм и более)

Форма правильно округлая, неправильная – ризоидная (корневидная), амебовидная.

Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные:

1) фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округлых или уплощенных зубцов правильной формы;

2) волнистый край, который несколько отличается от фестончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;

3) эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;

4) бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки.

Рельеф колонии характеризуется приподнятостью её над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Различают:

1) каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы с различно выраженной степенью выпуклости, которые в вертикальном разрезе представляют собой сегмент шара и отличаются только длиной радиуса.

2) колонии плоско-выпуклые с плоским верхом, пологими или круто обрывающимися краями; имеют в вертикальном разрезе форму трапеции;

3) колонии конусообразные, имеющие в вертикальном разрезе форму треугольника;

4) колонии с приподнятой в виде соска серединой и валиком по периферии; 5) колонии с вдавленным центром;

6) колонии плоские, стелющиеся по поверхности среды.

Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый».

Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссоциации. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается под действием антибиотико - и химиотерапии, факторов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также при попадании микробе во внешнюю среду.

Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, поэтому колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов.

По структуре различают следующие виды колоний:

1) гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

2) зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко - и грубозернистые;

3) нитевидные или волокнистые, характеризующиеся наличием длинных, густо переплетающихся нитей в толще колонии

Консистенцию колонии, определяющую ее физическое состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. Бывают: пастообразные, вязкие или слизистые, волокнистые или кожистые, хрупкие, сухие.

Рост на жидкихпитательных средах.

1. Рост с равномерным помутнением среды, цвет которой остается неизменным или изменяется в соответствии с цветом водорастворимого пигмента, образующегося в культуре микроба.

2. Придонный рост х-ся образованием осадка на дне, который может быть скудным или обильным. По внешнему виду крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных хлопьев. По консистенциивязким, слизистым, хрупким, или пастообразным. Пит.среда над осадком может быть прозрачной или мутной.

3. Пристеночны рост выражается в том,. что питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Бактерии растут, образуя более или менее крупные рыхлые хлопья или, наоборот, прикрепленные к внутренней поверхности стенок сосуда.

4. Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки, внешний вид и характер которой могут быть различны:

а) пленка тонкая, нежная, бесцветная, имеет вид едва, заметного налета, исчезающего при встряхивании пробирки;

б) пленка влажная, толстая, хорошо видимая простым. глазом, вязкой, слизистой консистенции, прилипает к петле - и тянется за ней;

в) пленка плотная, сухая, внешним видом напоминает кусочки кожи и при попытке взятия из нее материала;

г) пленка плотная, сухая, со сморщенной, а иногда бородавчатой поверхностью, краями прикрепленная к стенкам сосуда; при взбалтывании жидкости или прикосновении бактериальной петли разбивается на кусочки, погружающиеся в. глубь жидкости.

Цвет пленки, как и питательной среды, зависит от пигмента, вырабатываемого растущей культурой микробов. Рост бактерий в виде поверхностной пленки характерен для микробов-аэрофилов.

Рост на полужидкой питательной среде. Для выявления особенностей микробного роста на полужидкой питательной среде исследуемую культуру засевают в столбик 0,2—0,5% полужидкого агара. Для выявления особенностей микробного роста на полужидкой питательной среде исследуемую культуру засевают в столбик 0,2—0,5% полужидкого агара. Для того чтобы особенности роста проявлялись наиболее четко, прокол среды делают в непосредственной близости к стенке пробирки. Посев, произведенный таким образом, дает возможность выявить подвижные расы микробов и дифференцировать их от неподвижных.

Подвижные микробы в столбике полужидкого агара вызывают выраженное помутнение, распространяющееся более или менее равномерно по всей толщине среды.

Неподвижные формы микробов растут только по ходу прокола среды, напоминая сосульки цилиндрической или конической формы. При этом окружающая среда остается совершенно прозрачной.