Объяснение содержания лабораторной работы. Преподаватель дает информацию о ходе выполнения лабораторных работ и особенностях их постановки

Преподаватель дает информацию о ходе выполнения лабораторных работ и особенностях их постановки. Хроматографический метод анализа аминокислот является одним из методов разделения и идентификации аминокислот, определения аминокислотного состава белков и свободных аминокислот сыворотки крови, что имеет клиническое значение. При этом имеет значение степень растворимости аминокислот в воде, что определяет большее или меньшее продвижение их с подвижной фазой. Содержание аминокислот в сыворотке здоровых людей достаточно постоянно, но может меняться при ряде заболеваний (хронический гепатит, цирроз печени, наследственные заболевания и др.).

Осаждение белков из водных растворов наступает при воздействии водоотнимающих веществ, при кипячении, в изоэлектрической точке, т.е. при воздействии факторов, нарушающих стабилизацию белков в растворе, определяемую наличием заряда гидратной оболочки вокруг молекул белка.

Диализ – метод разделения веществ с помощью мембран, основанный на том, что высокомолекулярные коллоидные частицы белка не способны проникнуть через поры полупроницаемых мембран. В этом можно убедиться, проверяя в диализате присутствие белков. В качестве полунепроницаемой мембраны могут быть использованы искусственные мембраны, в том числе целлофан, а также лецитиновая мембрана, созданная сотрудниками ПятГФА (Н.Ш. Кайшева, С.В. Москаленко и др.).

Студенты выполняют работу индивидуально. Протокол оформляется в виде приводимых ниже таблиц, а работа по хроматографическому разделению аминокислот – в виде рисунка прибора для хроматографии и хроматограммы аминокислоты с приведением коэффициента Rf.

Самостоятельная работа студентов.

Студенты индивидуально и самостоятельно выполняют хроматографию аминокислот, реакции осаждения белков, диализ, используя в качестве ориентировочной основы действия, приводимые в практикуме описание лабораторных работ. Работу целесообразно начинать с постановки хроматограммы. Последней выполняется работа по осаждению белков. В процессе выполнения лабораторной работы преподаватель контролирует и корректирует работу студентов, чтобы научить их необходимым практическим навыкам. Результаты работ студенты показывают преподавателю, после чего оформляют протокол.

Итоговый контроль усвоения материала занятия.

Контроль усвоения материала может быть проведен в форме индивидуальной беседы в процессе проверки протоколов. Для проведения контроля рекомендуется использовать следующие вопросы:

1. Перечислите вещества, которыми можно осадить белки из раствора.

2. Каков механизм осаждения белков минеральными кислотами?

3. Каков механизм осаждения белков солями тяжелых металлов?

4. Для чего применяется диализ?

5. Как можно разделить альбумины и глобулины методом высаливания?

6. Для экстракции белков применяются солевые растворы и буферные смеси. Назовите методы, при помощи которых можно отделить белок от экстрагента.

7. На чем основана хроматография аминокислот?

8. Как рассчитывается коэффициент Rf, от чего он зависит?

9. Что такое коэффициент Rf?

10. Какая система была использована Вами для бумажной хроматографии? Укажите подвижную и неподвижную фазы.

11. Почему глутаминовая кислота в данной системе отличается наличием скоростного движения?

16. Какая из аминокислот (аланин, лейцин, глутаминовая кислота) обладает наибольшим Rf и почему?

17. Как влияют физико-химические свойства на показатель Rf?

18. Почему разные аминокислоты имеют определенные значения Rf? От чего это зависит?

19. Каким образом Вы доказали что белки не проходят, а низкомолекулярные компоненты проходят через мембрану?

20. Расскажите постановку опыта по очистке белков от низкомолекулярных примесей путем диализа.

Таблица 1

Диализ белков.

Принцип метода: Основан на способности мембран задерживать макромолекулы белка и пропускать неорганические ионы.

Определяемые компоненты	До диализа	После диализа
Внешняя жидкость	Внутренняя жидкость	Внешняя жидкость (диализат)	Внутренняя жидкость
Белок (с биуре-товым реактивом, 3-5 капель)	Нет окрашивания	Есть окрашивание	Нет окрашивания	Есть окрашивание
SО42- (с 2-3 каплями ВаСl2)	Нет осадка	Есть осадок	Есть осадок	Нет осадка

ВЫВОД: Мембрана задерживает переход белковых молекул через мембрану во внешнюю жидкость.

Таблица 2