Коррекция исходного уровня.

Коррекция исходного уровня знаний студентов проводится преподавателем во время ответа студента с привлечением всех студентов группы, которые могут внести свои исправления и дополнения к ответу.

Следует обратить внимание студентов на то, что биохимия в фармацевтическом институте является базисной дисциплиной для специальных дисциплин и знание ее материала необходимо для успешного усвоения курсов фармакологии, фармакогнозии, фармхимии, технологии лекарств.

В ходе собеседования следует выяснить степень понимания студентами предмета биохимии, ее задач, ее роли в познании живой материи, ее связи с медициной и фармацией. Следует подробно остановиться на характеристике живой материи и химических процессах, протекающих в живых организмах и лежащих в основе их жизнедеятельности. При объяснении материала и закреплении знаний целесообразно использовать контрольные вопросы по разделу.

Следует подробно разобрать основные элементы биохимического анализа и техники эксперимента, охарактеризовать применение в биохимических лабораториях физико-химических методов.

Следует объяснить, что при опытах на животных и при обследовании больных людей в биохимическую лабораторию направляют пробы биологических материалов и в них требуется определить одну или более составных частей. Точность анализа будет достаточной, если отбор материала, хранение (при необходимости) и транспортировка выполняются правильно. При характеристике биологических материалов (моча, кровь, кал) следует остановиться на особенностях их биохимического анализа.

 

Моча. Многие лабораторные анализы сдают при неумышленной потери части суточной мочи. Поэтому в каждом случае необходимо объяснить пациенту важность исследования и добиться его сотрудничества. Мочу собирают в двухлитровую стеклянную или полиэтиленовую бутыль и хранят, если возможно, в холодильнике до завершения 24-часового сбора. Количественные исследования многих порций мочи, за некоторыми исключениями, не имеют большой ценность и поэтому следует анализировать суточную мочу. Сбор начинают с опорожнения мочевого пузыря в данное время, эту порцию отбрасывают, а всю мочу с этого момента до того же часа следующего дня собирают. Иногда отдельно используется дневная и ночная моча. В эксперименте сбор мочи проводится в специальных обменных клетках или путём посадки мелких животных в стеклянную воронку.

Бактериальное загрязнение несущественно для большинства анализов мочи. Но, однако, если требуется, можно задержать рост бактерий путём добавления 1% толуола. Сулема удобна для предохранения образования осадков в моче, но делает её непригодной для дальнейших химических анализов. Для специальных анализов, таких как исследование гормонов, можно добавить 10мл конц. соляной кислоты на 1л мочи.

Кал. Кал не должен быть смешан с мочой или менструальной кровью. Кал часто собирают для изучения баланса отдельных веществ, например, жира, азота, кальция или железа. Суточные или трёхсуточные пробы метят следующим образом. Утром, натощак, больному дают 1г кармина в капсуле, а затем ещё раз утром последнего дня собирают кал от первого проявления краски до второго. Для некоторых анализов кал может быть высушен в струе горячего воздуха под тягой. В эксперименте кал собирают также, как и мочу.

Кровь. По возможности пробы могут быть получены из капилляров или вен. Чтобы получить микроколичество капиллярной крови применяют прокол мякоти пальца специальной иглой. При взятии крови у маленьких детей удобным местом для прокола является пятка. Поверхность кожи протирают спиртом и просушивают эфиром, затем делают прокол. Большие количества крови берут из локтевой вены. Для взятия крови из места укола пользуются абсолютно чистыми микропипетками, промытыми сначала хромовой смесью, затем дистиллированной водой, спиртом, эфиром и высушенные током воздуха. Кончик пипетки подводят сбоку в соприкосновение с каплей крови, причём, пипетку держат горизонтально, чтобы кровь легко входила в неё и поднималась в силу капиллярности. Набрав кровь до метки, кончик пипетки обтирают и кровь из пипетки вводят в соответствующий сосуд. Пипетку несколько раз ополаскивают дистиллированной водой и промывную жидкость также вливают в сосуд. Будет ли анализироваться цельная кровь или плазма, или сыворотка, определяется природой исследуемого компонента и его распределением. Если распределение одинаково в клетках и плазме, тогда могут быть использованы и кровь и плазма. Если же концентрация вещества выше в клеточных элементах, чем в плазме или сыворотке, то обычно лучше использовать последнее, так чтобы избыточного поступления исследуемого начала из клеток не происходило. Сыворотку легче получить без гемолиза, чем плазму, благодаря тому, что при этом применяется меньше манипуляций. Независимо от того, какая фракция крови нужна, всё время следует избегать воздействий, таких как взбалтывание, размазывание по стенкам сосуда, вспенивание, загрязнение, которые ведут к гемолизу. Различие между плазмой и сывороткой легко определить, зная способы их получения.

Плазма получается при смешивании крови с подходящим антикоагулянтом и последующим отделением плазмы от форменных элементов центрифугированием. В качестве антикоагулянтов, предотвращающих свёртывание крови путём связывания ионов кальция, обычно используют 0,1М растворы оксалата или цитрата натрия, которые добавляют к крови в соотношении 1:9. В результате из цельной крови получают клеточные элементы и плазму. Свёртывание крови может быть также предупреждено добавлением 2 мг гепарина к 10мл крови. Гепарин, обладая большим отрицательным зарядом, образует комплексы с белками, участвующими в свёртывании крови, и препятствует их взаимодействию между собой.

Когда необходимо получить сыворотку, кровь собирают в чистую сухую пробирку без антикоагулянта. Кровь оставляют свёртываться, и, если требуется полностью извлечь сыворотку, её оставляют в холодильнике на ночь. За это время происходит и свёртывание, и ретракция, а выделившуюся сыворотку легко отсосать пипеткой с оттянутым концом. При свёртывании крови из неё выпадает фибриноген в виде нитей фибрина и разрушаются некоторые ферменты. Поэтому сыворотка отличается от плазмы отсутствием фибриногена и некоторых других белков, участвующих в свёртывании крови, но зато в ней сохранены ионы кальция. В эксперименте кровь получают либо у интактного животного, либо у животного под наркозом, либо после его забоя. Наиболее просто взять кровь у кролика из краевой вены уха, у собаки - из вены задней конечности, у крысы - из хвоста или путём декапитации. В этих случаях взятие крови производят без наркоза, предварительно фиксируя животное.

Ткани и некоторые жидкости. Любые ткани, женское молоко, амниотическая жидкость, цереброспинальная жидкость, желудочный сок, рвотные массы, слюна и желчь могут быть объектами биохимического анализа. Ткани у людей берут путём биопсии (кожа, печень) с помощью специальных приспособлений (игла со шприцем). У животных любую ткань берут после забоя (декапитация, воздушная эмболия и др.).

Ткани и молоко, если их нельзя использовать в тот же день, следует хранить в замороженном состоянии при температуре не выше -20 °С. Перед анализом их размораживают. Другие упомянутые жидкости, экссудаты и транссудаты, можно держать в холодильнике при +4°С.

Для определения в тканях тех или иных веществ пользуются срезами тканей, тканевой кашицей, гомогенатами или экстрактом. Следует помнить, что в срезах клетки наименее травмируются, в кашицах травмирование тем больше, чем выше степень измельчения, в гомогенатах почти полностью разрушены форменные элементы органов, а в экстрактах налицо уже бесклеточная система. Вместе с тем диффузия метаболитов, а также проникновение в ткань кислорода или тех или иных вводимых в систему веществ происходит тем полнее, чем меньше величина частиц ткани в кашице. Для получения тканевой кашицы кусочек ткани, высушенный от крови фильтровальной бумагой, измельчают ножницами для получения кашицеобразной, гомогенной консистенции. Можно применять также растирание ткани в охлаждённой фарфоровой ступке с небольшим количеством тщательно промытого сухого кварцевого или стеклянного песка. Наибольшая степень измельчения достигается при помощи различных гомогенизаторов (с тефлоновым или стеклянным пестиком, гомогенизатора Уоринга и др.). Тканевые экстракты готовят для извлечения фермента или других веществ из тканевой кашицы или гомогената соответствующим растворителем с последующим центрифугированием. Навески тканей получают обычно с помощью торзионных весов. Готовые экстракты или гомогенаты берут для анализа пипетками разного объёма.

Разбор вопросов получения и хранения проб для биохимического анализа завершается демонстрацией и отработкой самими студентами техники приготовления кашиц и гомогенатов, техники взятия крови и сбора мочи, получения сыворотки и плазмы крови, техники работы с пипетками.

Далее преподаватель объясняет, каким образом пробы крови, ткани и др. биоматериалы подвергаются биохимическим исследованиям с использованием качественного и количественного анализа.

Методы качественного анализа могут иметь предварительное, ориентировочное значение.

С помощью качественных реакций биохимик сначала устанавливает, есть или нет, допустим, в моче сахар (реакция Фелинга) или кетоновые тела (пробой с индикаторной бумагой на ацетон). Если качественная реакция обнаружила в моче больного сахар, то есть смысл проводить количественный анализ с целью узнать, сколько же выделяется с мочой за сутки сахара у данного больного, если нет сахара в моче, то нет нужды в дальнейшем количественном анализе.

Качественные реакции выполняются быстро. Это экспресс-методы. В этом их преимущество. С их помощью можно быстро (1-2 минуты) получить подчас очень важные данные, к примеру, есть ли в моче сахар или ацетон (т.е. какая у больного кома, диабетическая на почве кетоацидоза или другая).

Данные, полученные при экспресс-анализе, позволяют распознать состояние больного и выполнить необходимые вмешательства для спасения его жизни.

Во многих случаях недостаточно тех сведений, которые даёт качественный анализ. К примеру, необходимо знать, сколько сахара выделяется с мочой у диабетика - много или мало, каков уровень сахара в крови. От этого зависит назначаемая доза инсулина и другие врачебные действия. Поэтому в биохимических лабораториях проводятся количественные анализы по определению концентрации тех или иных веществ в крови, моче, кале, слюне, желудочном или дуодуоденальном содержимом, выполняются количественные определения концентрации различных фракций белков сыворотки крови, что существенно для уточнения диагноза и определения тяжести многих заболеваний, холестерина и других липоидов - в диагностике атеросклероза, определение концентрации билирубина - в диагностике болезней печени, определение активности органо-специфических ферментов, например, креатинкиназы - при инфаркте миокарда, амилазы - при панкреатитах, концентрации в крови различных метаболитов, витаминов, гормонов и т.п.- для распознавания тех или других заболеваний и сопутствующих им отклонений в обмене веществ, обмене витаминов или в секреции гормонов.

В ряде случаев биохимическому анализу подвергаются ткани, особенно часто, в опытах на животных.

В количественном анализе используются методы разделения веществ, с одной стороны, и количественные аналитические методы определения концентрации конкретных веществ, с другой стороны.

Методы разделения веществ обычно используются для облегчения последующих количественных анализов конкретных веществ. К ним относятся такие приёмы и методы, как экстрагирование, осаждение, фильтрование, центрифугирование, электрофорез, хроматография.

Экстрагирование применяют для избирательного извлечения из исследуемого материала (крови, ткани, мочи и т.п.) тех веществ, которые нас интересуют. Например, все липиды и липоиды можно извлечь экстракцией с помощью смеси метанола и хлороформа (смесь Фолча) или смеси диэтилового эфира и этанола (смесь Блюра).

Осаждение применяют для избирательного удаления из исследуемого материала ненужных, или наоборот, представляющих интерес, веществ. Например, осаждая белки сыворотки крови трихлоруксусной кислотой или сернокислым цинком, мы избавляемся от белков, как ненужных веществ. Добавляя к экстракту смеси липидов дигитонин, мы можем избирательно осадить эфиры холестерина для их последующего количественного определения.

Фильтрование - этот приём используется и при экстрагировании и при осаждении. Промывая на фильтре исследуемый материал подходящим растворителем, мы добиваемся более полной экстракции из него ненужных веществ, переходящих в фильтрат. Или же посредством фильтрования мы отделяем осаждающиеся вещества, остающиеся на фильтре, от неосаждённых веществ, переходящих в фильтрат. Используется фильтрование под давлением или наоборот, при создании вакуума, «горячее» фильтрование, фильтрование через беззольные или стеклянные фильтры - в зависимости от задач исследования.

Центрифугирование - этот приём, требующий использования центрифуг, даёт тот же эффект, что и фильтрование. Преимущество центрифугирования - лучшее и нередко, более быстрое, разделение осадка и надосадочной жидкости, чем при фильтровании. Применяя всё возрастающее ускорение, можно из одной и той же смеси частиц осадить сначала самые крупные и тяжёлые (например, ядра клеток), затем более мелкие и лёгкие (например, митохондрии), затем, применяя огромные ускорения - можно даже разделить белки друг от друга (так называемое дифференциальное центрифугирование).

Электрофорез - этот метод используется для разделения веществ в поле постоянного тока, создаваемого в специальных аппаратах для электрофореза. Вещества, наносимые на подложку (фильтровальную бумагу или гель из крахмала), пропитанную буферным солевым раствором, в поле постоянного тока начинают двигаться с разной скоростью к аноду или катоду в зависимости от величины и знака заряда молекул разделяемых веществ и тем самым подразделяются на фракции. Метод обычно используется для фракционирования белков. Но он может применяться и для разделения на фракции других классов веществ, например, нуклеотидов. Нередко электрофорез сочетается с другими методами разделения веществ, основанными на других принципах: электрофорез, в градиенте рН, иммуно-электрофорез. Бесцветные вещества, например, белки после разделения выявляют, подкрашивая подложку специфическим красителем, который связывается с разделяемыми веществами. После отмывания избытка не связавшегося красителя, окрашенные пятна (например, фракции белков) становятся пригодными для определения количества белка в каждой фракции (это можно сделать, определяя размер и плотность окраски каждого пятна на специальных приборах - денситометрах или же вырезая из подложки пятна для последующей экстракции краски и колориметрии извлеченной краски, количество которой будет эквивалентно количеству белка в пятне фракции).

Хроматография - это метод разделения веществ между неподвижной и подвижной фазами. Различают распределительную и адсорбционную хроматографию. При распределительной хроматографии полоску бумаги пропитывают одним растворителем (это неподвижная фаза) и пропускают через эту бумагу другой растворитель, не смешивающийся с первым (это подвижная фаза). Нанесенная на бумажку смесь веществ будет разделяться на фракции в зависимости от того, в какой фазе (в каком растворителе) то или другое вещество лучше растворяется. Если вещество лучше растворяется в подвижном растворителе, то оно будет двигаться вдоль бумаги вместе с этим подвижным растворителем, отделяясь от вещества, оставшегося на месте нанесения из-за хорошей растворимости в неподвижном растворителе. В качестве подвижной фазы может служить не только жидкость, но и какой-либо газ, например, гелий или азот (газо-жидкостная хроматография). Следовательно, распределительная хроматография разделяет вещества в зависимости от различий их растворимости в подвижной и неподвижной фазах.

При адсорбционной хроматографии разделение веществ между подвижной и неподвижной фазами обусловлено различиями в адсорбции веществ на поверхности частиц, образующие неподвижную твердую фазу. При адсорбционной хроматографии стеклянную трубку ("хроматографическую колонку"), забив ее нижний конец ватой, наполняют подходящим твердым адсорбентом -порошком силикагеля или крахмала или еще чем-либо - это неподвижная фаза. Затем наливают сверху смесь разделяемых веществ в подходящем растворителе и пропускают через колонку (трубку с адсорбентом), все время добавляя растворитель (подвижная фаза). Одни вещества проходят через колонку не задерживаясь, другие же, связываясь с адсорбентом, задерживаются на колонке, прочно связываются или же покидают ее при последующем промывании колонки другим растворителем. Причем, одни вещества сразу смываются с колонки, а другие - позже, что и позволяет их отделять друг от друга, подставляя под колонку все новые и новые колбочки для сбора фракций. В качестве адсорбентов можно использовать также ионообменные смолы (катиониты или аниониты, избирательно задерживающие анионы или катионы).

Разновидностью адсорбционной хроматографии является "аффинная хроматография", позволяющая задерживать на колонке строго специфические вещества, комплементарные (аффинные) к материалу колонки. Например, к частицам адсорбента можно химически присоединить молекулы специфического антитела против какого-то одного определенного белка-антигена. Тогда такая колонка будет задерживать из смеси белков именно данный белок (антиген), вступающий в строго специфическое взаимодействие с антителами против этого белка, фиксированными на материале колонки.

Разновидностью адсорбционной хроматографии является так называемая тонкослойная хроматография, при которой адсорбент наносится в виде тонкого слоя на стеклянную пластинку. На такую подготовленную пластинку наносят (на один конец) смесь разделяемых веществ, затем погружают пластинку этим концом в растворитель. Поднимаясь по пластинке, растворитель увлекает за собой вещества, не связавшиеся с материалом неподвижной твердой фазы. Метод особенно удобен для разделения небольших количеств веществ и их окраски непосредственно на пластинке, без элюации.

Метод молекулярных сит. В хроматографических колонках можно разделять вещества, например, белки, по величине их молекул. В этом случае твердой неподвижной фазой являются порошки, состоящие из специально созданных поперечно сшитых молекул декстрана с определенной величиной ячеек (так называемые "сефадексы"). Один вид сефадекса задерживает самые большие белки (ячейки - "ловушки" большие), другой вид сефадекса, с меньшими размерами ячеек-ловушек, задерживает белки средних размеров, а сефадекс с совсем маленькими ячейками - соответственно задерживает самые маленькие белковые молекулы, пропуская без задержки крупные молекулы, которые не могут заходить и задерживаться в мелких ячейках.

Адсорбированное на колонке вещество можно смыть другим растворителем, уменьшающим сродство вещества к материалу колонки. Этот процесс носит название "элюция", а раствор вещества, вышедшего из колонок, называют "элюатом ". Хроматографироватъ, т.е. разделять можно не только окрашенные, но и бесцветные вещества. Но их приходится окрашивать в дальнейшем, после элюции, если есть необходимость количественно их определить. Хроматографически можно разделить аминокислоты друг от друга, но увидеть пятна аминокислот можно только после того, как хроматограмма опрыскана нингидрином и прогрета. Лишь после этого пятна аминокислот можно количественно измерять, определяя, сколько в данной смеси аминокислот содержится той или другой аминокислоты.

Методы электрофореза и хроматографии широко используются в повседневной практике современных клинических лабораторий. Идентификация (распознавание) разделенных при хроматографии веществ (а разделять можно все классы органических веществ) осуществляется с помощью "свидетелей", играющих роль эталонов сравнения. Свидетелями называют известные чистые вещества, которые хроматографируются в тех же условиях, что и неизвестные вещества исследуемой смеси. Положение пятна "свидетеля" на полоске хроматографической бумаги или на пластинке будет точно соответствовать положению пятна такого же вещества, выделенного из смеси.

В дальнейшем можно обходиться без свидетелей, ориентируясь на так называемый коэффициент распределения (Rf).

Важнейшими количественными аналитическими методами являются весовой, объемный, газовый анализ (или манометрические методы), электрохимические методы, метод меченых атомов, метод биологического тестирования, иммунологические методы. Все эти методы основаны на сравнении эффектов от неизвестного количества исследуемого вещества с эффектами от известного количества (эталона) этого же вещества.

Весовой метод. Взвешивая капельку крови или кусочек ткани до и после высушивания, можно количественно определить содержание в них воды. Выпарив липидный экстракт из определенного количества ткани (например, печени), взвесив сухой остаток экстракта, можно узнать концентрацию общих липидов в печени. Эталоном сравнения служат гири (разновес).

Объемный метод - (или титрование) - основан на использовании растворов известной концентрации (титрованных растворов), реагирующих в эквимолярных отношениях с раствором исследуемого вещества. Конец титрования определяется по изменению окраски индикатора. Примерами объемного анализа может служить алкалиметрия, ациметрия, йодометрия и т.п. Титрованный раствор (известной концентрации) служит эталоном сравнения.

Фотометрические методы - основаны на измерении поглощения света раствором изучаемого вещества по сравнению с поглощением света раствором того же вещества известной концентрации - "стандартного раствора" (эталон сравнения).

Эти методы пригодны для определения концентрации окрашенных веществ, поглощающих видимый свет, или бесцветных веществ, поглощающих свет в ультрафиолетовой или инфракрасной области спектра, а также для определения веществ, которые могут быть количественно превращены в окрашенные (светопоглощающие) продукты.

Для сравнения окраски растворов (т.е. поглощения ими света той или иной длины волны) используются визуальные фотометры (колориметры) или же фотометры с фотоэлементами (фотоэлектроколориметры). Так как каждое вещество избирательно поглощает свет с определенной длиной волны, то результаты колориметрии наиболее точны при пропускании через раствор света именно с такой длиной волны. Например, зеленые растворы сильнее всего поглощают красные лучи и различия в окраске таких растворов лучше всего выявляются при освещении именно красными лучами, которые можно выделить из света лампы, используя красные светофильтры, т.е. стекла красного цвета, пропускающие красные лучи. Разлагая лучи солнца или лампы призмой на составляющие (получая спектр), можно облучать исследуемый раствор монохроматическим светом строго определенной длины волны. Соответствующие приборы, в которых имеются подобные устройства ("монохроматоры") носят название спектрофотометров и используются для количественных анализов веществ методами адсорбционной спектрометрии.

Многие вещества при нагревании начинают испускать характерные лучи (например, соли натрия - желтые лучи), причем интенсивность свечения пропорциональна количеству вещества. Это явление используется в эмиссионном спектральном анализе, разновидностью которого является пламенная фотометрия. Многие вещества при их облучении ультрафиолетовыми лучами начинают вторично испускать лучи характерной для них длины волны (например, рибофлавин в ультрафиолетовых лучах испускает желто-зеленые лучи, а тиохром - голубые лучи). Это явление флюоресценции используется для количественного определения флюоресцирующих веществ в аппаратах электрофлюориметрах или спектрофотометрах.

Методы спектрофотометрии и флюорометрии могут использоваться для идентификации («узнавания») веществ по их характерным спектрам поглощения или испускания.

Например, в одной и той же пробе можно количественно определить различные каротины, т.к. каждый из этих пигментов имеет свой характерный максимум светопоглощения. Но для этого необходимо изменять длину волны источника монохроматического света и колориметрировать один и тот же раствор смеси каротинов в разных участках спектра.

При работе с фотоэлектроколориметром или спектрофотометром в начале исследуют светопоглощение растворов исследуемого чистого вещества разной концентрации и на основании полученных результатов строят график зависимости светопоглощения от концентрации вещества.

Такой график, представляющий обычно прямую линию, называют «калибровочной кривой». Это «скрытый» эталон сравнения. В дальнейшем достаточно фотометрировать только испытуемые вещества, находить их светопоглощение, а концентрацию определяемого вещества можно узнать, используя заранее полученную калибровочную кривую.

Газовый анализ - (или манометрические методы) - эти методы опираются на «газовые законы» физики, основанные на измерении объёма газа, выделяющегося или поглощаемого, или же на измерении давления такого газа при условии постоянного объёма в измеряющем устройстве (с поправкой на температуру). Методы используются для определения поглощения кислорода и выделения углекислого газа организмами, переживающими органами или кусочками тканей, но могут быть использованы для определения концентрации любых веществ, если их разрушение сопровождается выделением эквивалентного количества какого-либо газа (например, азота при разрушении мочевины бромноватистой щёлочью в аппарате Бородина).

Электрохимические методы - эти методы используются для определения концентрации электронов в растворах, например, для определения концентрации водородных ионов (т.е. рН) и основаны на измерении электролитов в растворах. Разновидностями электрохимических методов являются кондуктометрия, полярография.

Организация самостоятельной работы студентов.

Разбираются вопросы использования физико-химических методов в биохимических исследованиях с демонстрацией и отработкой студентами техники работы на торзионных весах, центрифуге, рефрактометре, фотоэлектроколориметре, бюретке и микробюретке. Проводится экстрагирование крахмала из исследуемого материала (картофеля) с последующим анализом экстракта на содержание крахмала. Демонстрируется сбор мочи и крови у крысы, помещенной в специальное устройство с последующим анализом мочи на наличие в ней глюкозы.

В качестве ориентировочной основы действия используется «Практикум по биохимии» (Строев Г.А., Макарова В.Г., 1986, стр.4-22).

Протокол занятия оформляется в рабочей тетради.

Самостоятельная работа студентов.

Студенты (каждый самостоятельно или группами по 2-3 человека) знакомятся и осваивают технику забора крови, мочи, тканей, приготовления кашиц и гомогенатов тканей, сыворотки и плазмы крови, технику работы с пипетками, микропипетками, бюретками, микробюретками, на торзионных весах, центрифуге, фотоэлектроколориметре, рефрактометре. Преподаватель контролирует и корректирует работу студентов, чтобы научить их необходимым практическим навыкам.

Итоговый контроль усвоения материала занятия.

Контроль усвоения материала занятия проводится в ходе разбора темы путем опроса, проверки правильности выполнения техники биохимического исследования и умения обращаться с приборами и оборудованием, а также индивидуальной беседы в процессе проверки протокола. Для проведения контроля рекомендуется использовать следующие вопросы.

1. Как провести забор крови из пальца человека?

2. Как провести забор крови у различных видов животных?

3. Как получить сыворотку и плазму крови?

4. Как следует собирать мочу и кал у человека?

5. Как можно собрать мочу и кал у животных?

6. Каким образом подготавливают пробу для биохимического анализа?

7. Как следует измерять объем пипеткой окрашенной и бесцветной жидкости?

8. Как следует работать с бюреткой и микробюреткой?

9. Как следует взвешивать пробу на торсионных весах?

10. Опишите последовательность работы на центрифуге.

11. Опишите правила работы на фотоэлектроколориметре.

12. Опишите правила работы на рефрактометре.

13. Каким образом осуществляют приготовление гомогената тканей?

14. Из каких этапов складывается определение содержания крахмала в картофеле?

15. Каким образом можно отделить осадок от жидкой фазы?

16. Почему измерение оптической плотности можно использовать для определения концентраций веществ?

 

Критерии достижения цели занятия.

1. Правильные ответы на поставленные вопросы.

2. Правильное выполнение технических приемов биохимического анализа (забор крови, биоматериала, приготовление проб для анализа, пользование пипетками и др.).

3. Умение обращаться с оборудованием и умение работать на приборах (фотоэлектроколориметре, рефрактометре, центрифуге, торсионных весах).

ЗАНЯТИЕ №2.

ТЕМА: Химическое строение белков. Качественные (цветные) реакции на функциональные группы белков и аминокислот.

Работа на занятии.

Цели занятия.

Студенты должны уметь:

- выполнить биуретовую реакцию на пептидную группу;

- выполнить нингидриновую реакцию на альфа – аминогруппу;

- выполнить ксантопротеиновую реакцию на ароматическое кольцо циклических аминокислот;

- выполнить реакцию Милона на тирозин;

- выполнить реакцию Фоля на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу;

- выполнить нитропруссидную реакцию на серосодержащие аминокислоты;

- провести идентификацию кислотно-основного состава исследуемого белка;

- установить подлинность препаратов белкового и аминокислотного состава.

Цели самоподготовки.

Студенты должны знать:

- общую характеристику белковых веществ;

- строение и свойства протеиногенных аминокислот – структурных мономеров белков;

- химическую связь в молекулах белков;

- строение пептидов.

Хронокарта занятия

Этапы занятия	Время	Дидактическая система
1. Организационные вопросы	2 мин	Классическая
2. Контроль исходного уровня знаний студентов и его коррекция	28 мин	Репетитор (хороший)
3. Организация самостоятельной работы студентов.	10мин	Технические средства обще – групповые
4.Самостоятельная работа студентов	80 мин	“Малая группа”
5. Итоговый контроль усвоения материала занятия	15 мин	Репетитор (хороший)

Оснащение занятия.

1. Оборудование: штатив с пробирками, капельницы, пипетки, водяная баня.

2. Реактивы: биуретовый реактив; нингидрин, 0,5% водный раствор; азотная кислота, конц.; реактив Милона; ацетат свинца, 5% раствор; гидроксид натрия, 20% раствор; нитропруссид натрия, 5% раствор.

3. Материалы для исследования: раствор яичного белка; 1% растворы глицина, глицилглицина, альфа – аланина, бета – аланина; 0,1% растворы фенилаланина, тирозина, цистеина, метионина, раствор желатина; раствор глутаминовой кислоты.

4. Таблицы: отрезок пептидной цепи, химические связи в белковой молекуле, пептидная связь.

Организационные вопросы.

Преподаватель выясняет, есть ли отсутствующие, обращает внимание на форму одежды студентов, сообщает цели занятия, интересуется посещаемостью лекций.

Контроль исходного уровня знаний студентов.

Контроль проводится в виде устного разбора материала темы и письменной контрольной работы с выставлением оценок в журнал.

 

Вопросы для устного опроса.

1. Каков химический состав белков?

2. Какова молекулярная масса белков и как она определяется?

3. Что такое аминокислоты и какие аминокислоты входят в состав белков?

4. Опишите классификацию протеиногенных аминокислот на основе полярности их радикалов. Какие типы классификации аминокислот известны и на каких принципах они основаны?

5. Перечислите аминокислоты первого класса и напишите их структурные формулы.

6. Перечислите аминокислоты второго класса и напишите их структурные формулы.

7. Перечислите аминокислоты третьего и четвертого классов и напишите их структурные формулы.

8. Каковы физико-химические свойства аминокислот?

9. Какие аминокислоты называются протеиногенными, а какие свободными?

10. Чем отличаются по свойствам D-аминокислоты от L-аминокислот?

11. Как образуются пептидные связи в белках?

12. Охарактеризуйте пептидную связь с электронной точки зрения.

13. Чем обусловлены цветные реакции на белки и аминокислоты?