Постановка реакції затримки гемаглютинації (РЗГА)мікрометодом

Реактиви та обладнання: антиген сухої вірус-вакцини проти хвороби Ньюкасла із штамів "Ла-Сота"; дослідні сироватки крові птиці; 1 %-ва суспензія еритроцитів півня на фосфатно-буферному розчині (ФБР) (рН 7,0; 7,2); піпетки градуйовані; дозатори автоматичні на 5-50 мкл і одноразові наконечники до них; мікротитратори одно або восьмиканальні будь-якої моделі з варіювальним або стабільним об'ємом у межах 0,025 ‑ 0,05 см³; полістиролові мікропанелі для імунологічних реакцій (V-варіант).

Підготовка антигену - вакцину в ампулах (флаконах) ресуспензують до вихідного об'єму вірусу.

Приготування еритроцитів півня-донора. Для отримання еритроцитів використовують півнів-донорів, які не вакциновані проти хвороби Ньюкасла і періодично перевіряються на відсутність антитіл. Кров беруть з підкрильцевої вени як мінімум від 3 півнів-донорів, змішують у рівному об'ємі у розчині Альсивера або у флаконі з 5 %-вим розчином лимоннокислого натрію на фізіологічному розчині (рН 7,0;7,2) у співвідношенні 1: 3, тричі відмивають фізіологічним розчином (0,1 М) або фосфатно-буферним розчином (ФБР) (рН 7,0; 7,2) і центрифугують при 800 об/хв протягом 2‑5 хв. З осаду еритроцитів готують 1 %-ву суспензію. Зберігати суспензію можна в умовах холодильника за температури 4 ^оС до появи ознак гемолізу еритроцитів. Крім нативних, у роботі можуть бути використані стабілізовані (формалінізовані) еритроцити півня.

РЗГА проводять поетапно, спочатку визначають гемаглютинувальний титр вірусу в РГА, для обчислення робочої дози вірусу, а потім становлять основну реакцію - визначення титру антитіл у досліджуваних сироватках крові.

Перший етап – постановка реакції гемаглютинації. 0,025 см³ фосфатно-буферний розчин (ФБР) вносять у кожну лунку V-подібної полістиролової пластини.

У першу лунку вносять 0,025 см³ суспензії вірусу. Для точного визначення рівня гемаглютиніну це необхідно робити з точного первинного розведення, наприклад 1 / 3, 1 / 5, 1 / 7 тощо.

Зробити подвійне розведення вірусу по 0,025 см³ через усю пластину. Додати по 0,025 см³ ФБР у кожну лунку. Додати по 0,025 см³ 1 % суспензії еритроцитів півнів у кожну лунку.

Злегка струсити пластину круговими рухами. Залишити для осідання еритроцитів протягом 40 хв. за кімнатній температурі (близько 20 ^оС) або на 60 хв за температури 4 ^оС (якщо зовнішня температура дуже висока) до тих пір, поки в контролі еритроцити осядуть у вигляді ґудзика.

Наявність гемаглютинації (ГА) визначається при нахилі пластини і виявленні стікання еритроцитів. Визначення титру гемаглютинації проводять за найбільшим розведенням, у якому виявлена гемаглютинація (немає стікання). Це розведення означає 1 гемаглютинувальну одиницю (ГАО) і має бути чітко вирахуваною з первинного розведення вірусу.

Другий етап - постановка реакції затримки гемаглютинації: 0,025 см³ фосфатно-буферного розчину (ФБР) вносять у кожну лунку V-подібної пластини, 0,025 см³ сироватки вносять в першу лунку кожного ряду пластини. Зробити подвійне розведення сироватки по 0,025 см³ через усю пластину. У кожну лунку вносять 0,025 см³ антигену, що містить 4 гемаглютинуючі одиниці (ГАО) вірусу, та залишають пластину на 30 хв за температури 20 ^оС або на 60 хв при 4 ^оС; 0,025 см³ 1 %-вої суспензії еритроцитів півня додати в кожну лунку, злегка струсити і дати осісти еритроцитам протягом 40 хв за кімнатної температури (близько 20 ^оС), якщо навколишня температура дуже висока, ‑ 60 хв за температури 4 ^оС. Еритроцити випадають в осад у вигляді ґудзика.

Титр затримки гемаглютинації визначається за найбільшим розведенням сироватки, яке дає повну затримку гемаглютинації 4 гемаглютинуючі одиниці (ГАО) вірусу. Наявність гемаглютинації визначається при нахилі пластини. Тільки в тих лунках, у яких стікання еритроцитів таке саме, як у контрольних лунках, у які залиті тільки 0,025 см³ еритроцитів і 0,05 см³ фосфатно-буферного розчину (ФБР), ураховується затримка гемаглютинації.

Достовірність результату необхідно оцінювати в порівнянні з негативним контролем, який не повинен давати титр 2.

Облік одержаних результатів. Рівень гуморального імунітету залежить від штаму використаних вакцин, методів їх застосування, строків вакцинації і ревакцинації та епізоотичної ситуації.

За результатами РЗГА визначають ефективність імунізації в партіях щепленої птиці у відсотках.

За вимогами серологічного контролю груповий імунітет уважається сформованим, а птиця - не сприйнятлива до хвороби Ньюкасла при наявності у 80 % і більше досліджуваних сироваток після щеплень живими вакцинами та у 90 % - після щеплень інактивованими вакцинами таких титрів антитіл:

- у курчат до місячного віку – 1: 8 і вище;

- у курчат від 30 до 60-добового віку – 1: 8 – 1: 16 (домінуючі) і вище;

- у молодняку від 60 до 140 діб – 1: 16 – 1: 32 (домінуючі) і вище;

- у дорослої птиці – 1: 32 – 1: 64 (домінуючі) і вище.

При ефективності імунізації менше 80 % після щеплень живими вакцинами та менше 90 % після застосування інактивованих вакцин птиця підлягає ревакцинації.

Граничними поствакцинальними титрами для курчат до двохмісячного віку є титри у співвідношенні 1: 512, а для птиці старших груп – 1: 1024.

Виявлення у щепленої птиці титрів антитіл 1: 4096 і вище через 6 місяців після вакцинації свідчить про можливу циркуляцію в стаді польового вірусу хвороби Ньюкасла. Така група птиці ставиться на ветеринарний контроль до одержання (через 2 тижні) результатів повторного дослідження проб парних сироваток крові в одних і тих самих птиці.

Зниження або стабілізація рівня антитіл та зменшення кількості птиці з високим рівнем антитіл при повторних дослідженнях проб сироваток крові є наслідком поствакцинальної реакції та свідчить про відсутність циркуляції в стаді польового вірусу хвороби Ньюкасла.

Приріст та збільшення кількості сироваток крові з високим рівнем антитіл – 1: 2048 ‑ 1: 4096 і вище через 21 добу після вакцинації, без видимих клінічних ознак і патолого-анатомічних змін у трупах птиці є підставою для проведення ретельного вивчення епізоотичної ситуації, клінічної та патолого-анатомічної картин серед птиці птахогосподарства, а також проведення систематичних серологічних та вірусологічних досліджень, виділення та ідентифікації вірусу.

При постановці діагнозу враховують лабораторні дослідження: виділення вірусу на курячих ембріонах, його індикація та ідентифікація в РГА-РЗГА, визначення вірулентності вірусу на курячих ембріонах та курчатах. Для підтвердження діагнозу використовують інші реакції: нейтралізації, крово-крапельну реакцію гемаглютинації, імуноферментний аналіз, полімеразну ланцюгову реакцію.

У зв'язку з масовим застосуванням у великих птахогосподарствах інактивованих вакцин проти хвороби Ньюкасла світових фірм-виробників з Франції, Нідерландів, Німеччини та інших у РЗГА реєструються високі титри антигемаглютинінів – 1: 4096 і вище до декілька десятків логарифмів. У таких випадках у зазначених птахогосподарствах посилюють ветеринарний контроль та обов'язково проводять дослідження парних сироваток крові від підконтрольної птиці.

Коли після вакцинації, протягом певного часу при повторному дослідженні парних сироваток з'являється строкатість показників (розбіжність більше 10 log), і титри залишаються незмінно високими, але не реєструються характерні клінічні ознаки та патолого-анатомічні зміни, такий стан є підставою для проведення поглибленого епізоотичного обстеження, систематичних серологічних та вірусологічних досліджень. Такі позамежові показники можуть виникати при внесенні у вакцину імуномодуляторів - препаратів селезінки великої рогатої худоби. Надалі при серійних дослідженнях (через 14 діб) парних сироваток у благополучних господарствах титри будуть суттєво знижуватися.