Постановка реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) макрометодом

Обладнання та реактиви: антиген сухої вірус-вакцини проти хвороби Ньюкасла із штамів "Ла-Сота", екстраембріональна алантоїсна рідина від курячих ембріонів, інфікованих вакцинними штамами вірусу хвороби Ньюкасла, з гемаглютинувальним титром не менше 1: 8; дослідні сироватки крові птиці; 1 %-ва суспензія еритроцитів півнів-донорів на фосфатно-буферному розчині (ФБР), рН 7,0, 7,2, 7,4; контрольні (еталонні) позитивні та негативні сироватки; пластини полістиролові титраційні з лунками, позначеними літерою "V"; центрифуга лабораторна на 2000 об/хв; наконечники одноразові; піпетки градуйовані на 1,0; 2,0; 5,0 і 10,0 мл або дозатори автоматичні на 50‑200 мкл, 1000 мкл; розчин фізіологічний 0,87 %-вий з рН 7,0‑7,2; вода дистильована; колби конічні скляні на 50 см³, 250 см³, 1000 см³ з лабораторними пробками; штативи лабораторні бактеріологічні для пробірок; пробірки лабораторні скляні на 5 см³, 10 см³, 15 см³, 20 см³; шафа сушильна; ваги лабораторні з похибкою зважування не більше 0,01 г; кювети лабораторні (зливні); натрію хлорид; пробірки для центрифуги; камера холодильна; розчин для дезінфекції: 3 %-вий розчин їдкого натру або інші дезінфекційні розчини; ємність зливна для відпрацьованого матеріалу; 5 %-вий розчин лимоннокислого натрію на фізіологічному розчині або розчин Альсивера (24,6 г глюкози, 9,6 г лимоннокислого натрію, дистильованої води 1200см³); термостат на 37 ^оС.

Підготовка антигену. Вміст ампули (флакона) сухої вірус-вакцини з штаму "Ла-Сота" (активністю не менше 8,5 lg EID 50 см³) розчиняють фізіологічним розчином у співвідношенні 1: 5.

Приготування 1 %-вої суспензії еритроцитів півнів-донорів. Для одержання 1 %-вої суспензії еритроцитів беруть кров тільки у не вакцинованих проти хвороби Ньюкасла півнів-донорів старше 6-місячного віку, еритроцити яких не дають спонтанної аглютинації і сироватки крові періодично перевіряються на відсутність антитіл до хвороби Ньюкасла.

Кров беруть не менше ніж у трьох півнів, з підкрильцевої вени в колбу з розчином Альсивера в рівних об'ємах або у флаконі з 5 %-вим розчином лимоннокислого натрію на фізіологічному розчині (рН 7,0‑7,2) у співвідношенні 1: 3. Одержану кров тричі відмивають фізіологічним розчином (0,1 М) або фосфатно-буферний розчин (ФБР) рН 7,0; 7,2, осаджуючи еритроцити, центрифугуючи протягом 2‑5 хв при 800 об/хв. З осаду відмитих еритроцитів готують 1 %-ву суспензію і зберігають не більше як 2 доби при темпаратурі 4 ^оС.

Промиті та ущільнені еритроцити зберігають у вигляді 50 %-вої суспензії на фізіологічному розчині (рН 7,2) протягом 5 діб за температури 4 ^оС в холодильній камері у скляній колбі з ватно-марлевою пробкою.

Одержання дослідних сироваток. Проби крові набирають в окремі пронумеровані пробірки, попередньо зволожені стерильним фізіологічним розчином. Утворений згусток обводять тонким металевим стержнем або скляною паличкою, потім пробірки вносять у термостат на 20‑30 хв при 37 ^оС. Далі проби крові витримують у холодильнику за 4 ^оС до утворення сироватки. Відстояну сироватку зливають у чисті пронумеровані пробірки і досліджують в РЗГА.

Сироватки крові інших видів птиці можуть викликати аглютинацію еритроцитів півнів. Тому в разі виявлення такої особливості проводять додаткову обробку сироваток еритроцитами. Для цього 0,025 см³ осаду еритроцитів додають до 0,5 см³ сироватки, струшують та залишають на 30 хв. Еритроцити осаджуються центрифугуванням при 800 об/хв протягом 2‑5 хв та оброблену сироватку зливають.

РЗГА ставлять у два етапи:

- титрування антигену в реакції гемаглютинації (РГА) для обчислення робочої дози вірусу;

- постановка основної реакції.

РЗГА супроводжується контролями:

- сироватки на ізоаглютинацію (сироватка + фосфатно-буферний розчин (ФБР) в рівних об'ємах + 1 %-ва суспензія еритроцитів в подвійному об'ємі). Аглютинація повинна бути відсутня;

- еритроцитів на спонтанну аглютинацію (суспензія еритроцитів + фосфатно-буферний розчин (ФБР) у рівних об'ємах). Аглютинація повинна бути відсутня.

Перший етап ‑ титрування антигену в РГА. Спочатку готують подвійні розведення антигену від 1: 2 до 1: 4096. Для цього в усі лунки полістиролових пластин наливають фосфатно-буферний розчин (ФБР) в об'ємі 0,25 см³. Потім у першу лунку вносять 0,25 см³ вірусу, новою піпеткою три рази піпетують і переносять 0,25 см³ суміші в другу лунку до потрібного розведення. З останньої лунки 0,25 см³ суміші видаляють у дезрозчин. У кожну лунку новою піпеткою додають по 0,25 см³ 1 %-вої суспензії еритроцитів півнів.

Паралельно ставлять контроль еритроцитів на спонтанну аглютинацію, для чого в три лунки наливають по 0,25 см³ фосфатно-буферний розчин (ФБР) і новою піпеткою додають по 0,25 см³ 1 %-вої суспензії еритроцитів. Полістиролові пластинки струшують обережними круговими рухами і залишають за кімнатної температури (18‑20 ^оС) на 30‑45 хв для осідання еритроцитів у контролі.

Результати РГА виражають хрестами, в залежності від ступеня інтенсивності реакції.

Реакція на три хрести (+ + +). По периметру лунки утворюється осад у вигляді "парасольки" з рожевими краями.

Реакція на два хрести (+ +). Пройшла менш інтенсивна аглютинація, при цьому аглютиновані еритроцити мають зубчатий вигляд.

Реакція на один хрест (+) має вигляд незначної аглютинації на дні лунки.

Негативна реакція (-) аналогічно контролю має вигляд ґудзика, який при нахилі пластини стікає.

За гемаглютинувальний титр вірусу або одну гемаглютинувальну одиницю 1 (ГАО) приймають найбільше розведення, де чітко виражена аглютинація еритроцитів у вигляді парасольки, але не менш як на 2 хрести.

Наприклад, чітко виражена гемаглютинація, одержана в розведенні 1: 64, тобто 0,25 см³ вірусу в розведенні 1: 64, містить одну гемаглютинувальну одиницю (1 ГАО). Для постановки РЗГА потрібно брати 4 ГАО в 0,25 см³, що становить робочу дозу вірусу, яка використовується при постановці основної реакції.

Для визначення робочої дози граничний титр вірусу ділять на 4, тобто в наведеному прикладі 4 ГАО в 0,25 см³ будуть міститися при розведенні вірусу 1: 16 (64: 4=16).

Для приготування робочого розведення вірусу, який містить 4 ГАО в 0,25 см³, потрібно взяти 1 см³ вихідного вірусу і додати 15 см³ ФБР. Підібрану робочу дозу вірусу необхідно використати протягом 8 год.

Перед постановкою РЗГА необхідно перевірити правильність вибраної робочої дози вірусу (4 ГАО). Для цього в 4 лунки одного ряду і 3 лунки контрольного ряду наливають по 0,25 см³ ФБР. У першу лунку з 4 наливають 0,25 см³ робочої дози вірусу. Новою піпеткою суміш тричі піпетують, а потім переносять по 0,25 см³ в наступну лунку та ін. Із останньої лунки 0,25 см³ суміші видаляють у дезрозчин. Після цього у лунки з антигеном та лунки контрольного ряду додають 0,25 см³ 1 %-вого розчину еритроцитів півнів, струшують круговими рухами і залишають за кімнатної температури (18-20 ^оС) на 30‑45 хв.

Облік реакції проводять після осідання еритроцитів у контролі. При правильному виборі робочої дози вірусу (4 ГАО) у першій та другій лунках повинна бути повна аглютинація ("парасолька"), а в третій може бути часткова (+); у четвертій - аглютинація відсутня ("ґудзик") - негативний результат.

При одержанні інших показників з основного розведення вірусу готують нове робоче розведення (більше або менше).

Більше розведення готують за наявності аглютинації в 4-й лунці, менше - за відсутності аглютинації в 2-й лунці, тобто збільшують або зменшують концентрацію вірусу. Якщо аглютинація проявляється лише в 4-й лунці, то 1 см³ вірусу розчиняють в 24 см³ фосфатно-буферному розчині (ФБР), додаючи до вихідного розрахункового об'єму (1: 16) ще половину, а якщо аглютинація відсутня в 2-й лунці, то 1 см³ вірусу розчиняють в 8 см³ фосфатно-буферному розчині (ФБР), тобто беруть половину первинного розрахункового об'єму. Після приготування нового робочого розведення знову ставлять контроль до отримання необхідного результату в реакції аглютинації.

Другий етап - постановка РЗГА. Для постановки реакції в 12 лунок титраційної пластини піпеткою вносять по 0,25 мл фосфатно-буферного розчину (ФБР). Потім у першу лунку новою піпеткою вносять 0,25 см³ дослідної сироватки, тричі піпетують і 0,25 см³ суміші переносять у наступну лунку та ін. до одержання граничного розведення. З останньої лунки 0,25 см³ суміші видаляють піпеткою в ємність з дезрозчином. Після цього в усі лунки новою піпеткою вносять по 0,25 см³ робочого розведення вірусу (4 ГАО). Пластини струшують круговими рухами та після 30‑45-хвної взаємодії сироватки з вірусом у кожну лунку додають по 0,5 см³ 1 %-вої суспензії еритроцитів.

Реакцію ставлять за кімнатної температури (18‑20 ^оС) і ведуть облік результатів протягом 25‑45 хв.

За наявності в сироватці антитіл настає затримка гемаглютинації, при цьому еритроцити випадають в осад у вигляді ґудзиків з рівними краями.

Титром сироватки вважають найбільше її розведення, яке дає чітку затримку гемаглютинації (наявність "ґудзика") робочої дози антигену збудника хвороби Ньюкасла.

Достовірність результату необхідно оцінювати в порівнянні з негативним контролем, який не повинен давати титр 2.

За правильного приготування і розведення антигену еталонна сироватка має пригнічувати його гемаглютинацію до зазначеного на етикетці титру.