Ферменты, катализирующие разложение растительных материалов

Г Л А В А 4

Эффективность биотехнологических процессов переработки растительных субстратов зависит от потребления трех основных компонентов: целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Деградация этих полимеров в природе осуществляется преимущественно благодаря действию специфических ферментов микроорганизмов. Способность к образованию ферментов, участвующих в разложении полисахаридов и лигнина растительных материалов встречается у различных микроорганизмов. При этом ферменты, разрушающие тот или иной компонент растительной биомассы, объединены в соответствующие ферментные комплексы: целлюлазно-гемицеллюлазный, пектиназный, лигниназный.

Большинство ферментов, входящих в состав этих комплексов, синтезируются почти всеми организмами в виде целого ряда изоферментов, отличающихся субстратной специфичностью, сродством к различным формам нерастворимого субстрата и ролью его в деструкции. Отношение между ферментами внутри комплекса являются синергическими: синергизмом называют увеличение эффективности действия двух или нескольких компонентов системы при их совместном присутствии по сравнению с суммарным проявлением действие этих ферментов по отдельности.

Имеющиеся, в настоящее время обширные данные о ферментативных системах, которые участвуют в разложении полисахаридов растительного сырья и лигнина, свидетельствуют о значительном интересе к изучению биохимических особенностей и механизмов действия ферментов, входящих в состав соответствующих ферментных комплексов, а так же о необходимости дальнейшей интенсификации этих исследований, с целью последующего использования полученных результатов в проектировании реальных экологически безопасных технологий.

Согласно номенклатуре ферментов Международного биохимического союза ферменты, катализирующие разложение растительных субстратов, принадлежат в основном к гликозилгидролазам (КФ 3.2.1), расщепляющих гликозидные связи в полисахаридах растительных клеточных стенок.Значительно ускоряют процессы разложения растительных субстратов некоторые типы эстераз (КФ 3.1.), Так, например, пектинэстеразы (пектиндеметилазы, КФ 3.1.1.11), ацетилксиланэстеразы или ферулоилэстеразы, расщепляя сложноэфирные связи между углеводным остатком гемицеллюлоз и остатком уксусной, феруловой или диферуловой кислоты, или в метиловых эфирах галактуроновой кислоты в составе пектина, разобщают сшитые диферулатными мостиками молекулы арабиноксилана и пектина, а также отделяют лигнин от полисахаридов. Среди гидролаз, действующих на компоненты растительной клеточной стенки, условно выделяют:

1. Гидролазы, расщепляющие структурно-упорядоченную часть целлюлозы. К ним относятся преимущественно целлобиогидролазы грибов и бактерий.

2. Гидролазы, расщепляющие линейные цепи в составе аморфного матрикса, окружающего кристаллиты целлюлозных фибрилл, в том числе и нековалентно связанные с целлюлозой полисахариды. К ним принадлежат эндоглюканазы, ксилоглюкан-гидролазы, эндоксиланазы, эндоманнаназы, эндо-1,3-β-глюканазы.

3. Гидролазы, отщепляющие боковые ответвления, точки связывания гемицеллюлоз и пектинов с лигнином. Это гликозидазы: α-L-арабинозидазы, α-D-глюкуронидазы, α- и β-галактозидазы, β-глюкозидазы, β-маннозидазы, α- и β-ксилозидазы, α-фукозидазы, а также эстеразы: ацетилксиланэстеразы, ферулоилэстеразы.

4. Ферменты, вызывающие мацерацию. К ним относятся эндо- и экзополигалактуроназы, β-галактаназы, α-L-арабинаназы, рамногалактуроназы, α-рамнозидазы, пектин-метилэстеразы (КФ 3.1.1.11), специфические протеазы коллагеназного типа протеогликангидролазы, которые вызывают разделение растительных клеток вдоль составной срединной пластины.

5. Гликозилгидролазы, характеризующиеся трансферазной (КФ 2.4.1) активностью и способные параллельно с гидролизом переносить отщепляемые моно-, олиго- или полисахаридные фрагменты на первичный (реже вторичный) гидроксил углеводного остатка или свободный фенольный гидроксил фенилпропаноидных структур. К ним принадлежат эндогликаназы и гликозидазы, сохраняющие конфигурацию расщепляемой связи у продуктов реакции, а также ксилоглюкан-эндотрансферазы. Они выполняют соединение частей аморфного полисахаридного матрикса, покрывающего целлюлозу и присоединение его через лигноуглеводные связи к лигнину.

В таблице 4 представлен список основных ферментов в соответствии с традиционной номенклатурой ферментов, классифицирующей ферменты по типу расщепляемой гликозидной связи.

Таблица 4

Ферменты, расщепляющие гликозидные связи в растительных полисахаридах *

Тривиальное название	Тип расщепляемой связи	КФ	Систематическое название
Целлюлаза, эндоглюканаза	(Glc)n-β-1,4-(Glc)n	3.2.1.4	1,4-β-глюкан-глюканогидролаза
Ксиланаза, эндоксиланаза	(Xyl)n-β-1,4-(Xyl)n	3.2.1.8	1.4-β-ксилан-ксиланогидролаза
Пектиназа, эндополигалактуроназа	(GalpA)n-α-1,4-(GalpA)n	3.2.1.15	1,4-α-полигалактуронан-галактуронаногидролаза
-глюкозидаза (целлобиаза)	Glc-β-	3.2.1.21	-глюкозидгидролаза
-галактозидаза (мелибиаза)	Gal-α-	3.2.1.25	-галактозидгидролаза
-галактозидаза (лактаза)	Gal-β-	3.2.1.23	-галактозидгидролаза
-маннозидаза	Man-β-	3.2.1.25	-маннозилгидролаза
-глюкуронидаза	GlcA-α-	3.2.1.31	-глюкуронидгидролаза
Экзо-1,3-β-ксилозидаза	Xyl-β-1,3-(Xyl)n	3.2.1.32	1,3-β-D-ксилан-ксилогидролаза
Экзо-1,4-β-ксилозидаза	Xyl-β-	3.2.1.37	1,4-β-D-ксилан- ксилогидролаза
Эндо-1,3-β-глюканаза	(Glc)n-β-1,3-(Glc)n	3.2.1.39	1,3-β-глюкан-глюканогидролаза
-L-рамнозидаза	Rha-α-	3.2.1.40	-рамнозилгидролаза
-L-фукозидаза	Fuc-α-	3.2.1.51	α-фукозидгидролаза
-L-арабинофуранозидаза	Araf-α-	3.2.1.55	α-L-арабинофуранозидгидролаза
Экзо-1,3-β-глюканаза	Glc-β-1,3-(Glc)n	3.2.1.58	1,3-β-глюкан-глюкогидролаза
1,2-α-L-фукозидаза	Fuc-α-1,2-Gal-β-	3.2.1.63	2-O-альфа-L-фукопиранозил-β-галактозид фукогидролаза
Экзополигалактуроназа	GalpA-α-1,4-(GalpA)n	3.2.1.67	1,4-альфа-полигалактуронан-галактуроногидролаза
Экзо-1,3-β-ксилозидаза	Xyl-β-1,3-Xyl-	3.2.1.72	1,3-β-ксилан-ксилогидролаза
Экзоглюкозидаза	Glc-β-1,4-(Glc)n	3.2.1.74	1,4-β-глюкан-глюкогидролаза
Эндоманнаназа	(Man)n-β-1,4-(Man)n	3.2.1.78	1,4-β-маннан-маннаногидролаза
Экзопектиназа, экзополигалактуроназа	(GalpA)2- -1,4-(GalpA)n	3.2.1.82	1,4-α-Полигалактуронан-дигалактуроногидролаза
Эндо-1,4- -D-галактаназа	(Gal)n-β-1,4-(Gal)n	3.2.1.89	1,4-β-арабиногалактан-галактаногидролаза
Эндо-1,3- -D-галактаназа	(Gal)n-β1,3-(Gal)n	3.2.1.90	1,4-β-арабиногалактан-галактаногидролаза
Экзоцеллобиогидролазы	(Glc)n-β-1,4-(Glc)2, (Glc)2-β-1,4-(Glc)n	3.2.1.91	1,4-β-глюкан-целлобиогидролаза
Эндо-арабинаназа	(Araf)n-α-1,5-(Araf)n	3.2.1.99	1,5-α-L-арабинан-1,5-α-L-арабинаногидролаза
Экзо-β-маннаназа	(Man)2-β1,4-Man)n	3.2.1.100	1,4-β-маннан-маннобиогидролаза

*Кроме перечисленных в таблице ферментов имеются гликозилгидролазы не вошедшие в этот список: α-ксилозидаза, рамногалактуронангидролаза и др.

Современная систематика энзимов основывается не только на их субстратной специфичности, но и на структурных признаках ферментов, Это связано во-первых, с тем, что, абсолютная субстратная специфичность по отношению к типу гликозидной связи – встречается не у всех ферментов и имеются ферменты, совмещающие несколько типов активностей в одном активном центре (в частности, целлюлазы-ксиланазы), а во-вторых, молекулярные структуры ферментов с общей специфичностью весьма разнообразны и во многих случаях они сильно отличаются друг от друга. Кроме того, обнаружено множество примеров ферментов-химер, которые на С- и N-концах одной молекулы несут два активных центра различной специфичности. Примером являются целлюлолитические ферменты, которые в современной классификации составляют многочисленную группу гликозилгидролаз из 15 семейств и нескольких подсемейств.

Целлюлазы

Целлюлазы – это комплекс ферментов, включающий ферменты, которые осуществляют гидролиз целлюлозы до ее мономера путем расщепления 1,4-β-гликозидной связи между остатками D-глюкозы, а также ферменты иной специфичности или некаталитические белки, действующие на поверхности целлюлозы.

Целлюлолитические ферменты продуцируются грибами, актиномицетами, бактериями, некоторыми беспозвоночными животными и растениями. У микроорганизмов и беспозвоночных животных роль этих ферментов заключается в расщеплении целлюлозы до глюкозы, которая используется ими как источник углерода и энергии. Микроорганизмы-фитопатогены синтезируют целлюлазы для разрушения растительной клеточной стенки и проникновения в цитоплазму. Целлюлолитические ферменты растений играют важную роль в процессе роста клетки, опаде листьев, удлинении пыльцевой трубки, созревании плодов, дифференциации сосудов.

Целлюлолитическая активность обнаружена в гепатопанкреасе и кристаллическом стебельке моллюсков, переваривающем соке улиток, в слюнных железах и пищеварительных органах термитов и ряда других насекомых. Обнаруживаемая у этих организмов целлюлазная активность, в ряде случаев принадлежит микроорганизмам, живущим в их пищеварительных органах. У позвоночных животных способность усваивать целлюлозу связана с наличием целлюлолитической микрофлоры, состоящей из бактерий и микроскопических грибов.

Аэробные микроорганизмы могут секретировать практически весь целлюлазный комплекс за исключением целлобиаз, являющихся в основном внутриклеточными, в среду к субстрату. Уровень внеклеточных и связанных с клеткой целлюлаз может регулироваться путем использования различных источников углерода в питательной среде. Процессы секреции целлюлаз зависят от состояния мембран клетки и клеточной поверхности. Существует мнение о том, что наличие у целлюлаз углеводной части способствует удержанию ферментов у гиф грибов. У гриба Phanerochaete chrysosporium гифы окружены оболочкой, которая состоит из β –1,3 и β-1,4 глюкана, образующего соединительный элемент между грибом и клеточной стенкой растительного субстрата. Показано, что целлюлозоразрушающие грибы имеют одну белково-липидную мембрану, а лигнинразрушающие – две и их толщина может варьировать от вида. У анаэробов, жизнедеятельность которых происходит преимущественно в значительных обьемах жидкости, целлюлазы действуют в составе сложных надмолекулярных ансамблей – целлюлосом и полицеллюлосом.

Общая характеристика и классификация ферментов целлюлазного комплекса

Ферментная система «целлюлазы» объединяет спектр белков, способных гидролизовать полимерные молекулы целлюлозы, либо специфически связываться с ее поверхностью. К целлюлолитическим ферментам относятся целлобиогидролазы, без которых разрушить структуру упорядоченной части целлюлозы невозможно, а так же эндоглюканазы и другие ферменты, освобождающие поверхность микрофибрилл целлюлозы от сопутствующего аморфного матрикса или способствующие их освобождению (гликозидазы, ацетилксиланэстеразы, ферулоилэстеразы). Кроме того, сюда включены и некаталитические белки целлюлосом анаэробных бактерий скаффолдины, содержащие целлюлозосвязывающий домен (ЦСД), а также белки, гомологичные каталитическим доменам (КД) или ЦСД целлюлаз, и разнообразные структурные элементы, соседствующие в этих белках с КД или ЦСД.

Согласно традиционной номенклатуре к основным типам ферментов, способных расщеплять гликозидные связи в целлюлозе относятся эндоглюканазы, экзоцеллобиогидролазы, целлобиазы, экзоглюкогидролазы.

Эндоглюканазы или 1,4-β-глюкан- глюканогидролазы (КФ 3.2.1.4) - гидролизируют β -1,4-связи в β- 1,4-глюканах. Они способны с одинаковой вероятностью гидролизовать любую из гликозидных связей в молекуле целлюлозы, включая и самые крайние. Однако при достаточно высокой степени полимеризации молекулы субстрата суммарная вероятность действия эндоглюканаз на внутренние гликозидные связи будет выше, чем на две крайние связи. Поэтому, продуктами действия эндоглюканаз в основном являются фрагменты молекул целлюлозы произвольной длины. Эндо-1,4-β-глюканазы снижают вязкость растворов производного целлюлозы — карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), расщепляя КМЦ до восстанавливающих сахаров. Продуцируют эндоглюканазы грибы, бактерии, высшие растения и некоторые беспозвоночные животные. Молекулярная масса выделенных эндоглюканаз колеблется в пределах 20-70 кДа, хотя некоторые микроорганизмы синтезируют эндоглюканазы с молекулярной массой 10-14 кДа и 140 кДа. Множественные формы эндоглюканаз образуют грибы. В составе целлюлазного комплекса Trichoderma reesei обнаружены эндоглюканазы (EG): І (cемейство7); ІІ (семейство5); ІІІ (семейство 12); ІΥ (семейство 61); Υ (семейство 45), которые различаются молекулярной массой, изоэлектрическими точками, характером воздействия на субстрат и вследствие этого выполняют различные функции при ферментативном разложении целлюлозы. Изучение содержания множественных форм эндоглюканаз в процессе роста культуры Geotrichum candidum показало, что состав и относительное содержание эндоглюканаз 48, 72 и 96-часовой культуры различны. Выделенные эндоглюканазы характеризовались разной способностью расщеплять до сахаров КМЦ, хлопковое волокно они гидролизовали в незначительной степени, а микрокристаллическую целлюлозу авицел до сахаров не расщепляли совсем.

Большая часть эндоглюканаз — гликопротеины, содержат углеводы, ковалентно присоединенные к молекуле белка. Изучение аминокислотного состава эндо-1,4-β-глюканаз грибов свидетельствует о том, что это кислые белки, в состав которых входит большое количество дикарбоновых и оксиаминокислот.

Экзоцеллобиогидролазы или 1,4-β-глюкан-целобиогидролазы (КФ 3.2.1.91.) - действуют на вторую от конца молекулы целлюлозы гликозидную связь с образованием целлобиозы. Ферменты обладают высокой специфичностью - гидролизуют β -1,4-глюканы, но не действуют на β-1,3- и β-1,6-глюканы.

Известно два типа целлобиогидролаз - I и II. Первая гидролизует целлюлозную цепь с восстанавливающего конца по направлению к невосстанавливающему, а вторая - наоборот, начинает вести гидролиз с невосстанавливающего конца. Значительная часть этих ферментов имеет молекулярную массу 30-70 кДа. Экзоцеллобиогидролазы из Trichoderma viride, Sporotrichum pulverulentum содержат большое количество кислых и гидрофобных остатков аминокислот и 16 остатков полуцистина, что указывает на жесткую структуру этих белков. В молекуле экзоцеллобиогидролазы Sclerotium rolsii остатков полуцистина не обнаружено. Многие целлобиогидролазы содержат в молекуле углеводы, в состав которых входят глюкоза, глюкозамин, галактоза, манноза, ксилоза. Целлобиогидролаза I является основным компонентом грибных целлюлаз. Она необходима для расщепления нативной целлюлозы. При воздействии на субстрат целлобиогидролаза I сохраняет конфигурацию расщепляемой связи в продуктах реакции и катализирует процессы трансгликозилирования.

Целлобиогидролаза II катализирует гидролиз гликозидных связей с обращением конфигурации у аномерного углерода. Специфичность целлобиогидролазы II узкая — она не действует на гетерозидную связь во флуорогенных производных целлоолиго-сахаридов, не расщепляет лактозиды.

Большинство целлобиогидролаз - гликопротеины, с содержанием до 9% нейтральных углеводов, состоящих в основном из маннозы, небольшого количества глюкозы, галактозы и глюкозамина.

Целлобиазы или (глюкозидгидролазы) β – глюкозидазы (КФ 3.2.1.21) - практически не действуют на полимерные молекулы целлюлозы, но могут расщеплять короткие целлоолигосахариды, в состав которых входит до 6 глюкозных единиц, причем, с возрастанием молекулярной массы олигосахарида, катализирующая способность целлобиазы уменьшается. Многие целлобиазы не специфичны по отношению к определенному типу связи. В ходе реакции могут расщепляться и β -1,2, β -1,3, β -1,4 и β-1,6- связи. От содержания и свойств β-глюкозидаз зависит глубина расщепления целлюлозы. β-глюкозидазы продуцируют микроорганизмы, растения, животные. Расщепляя с помощью целлобиаз β-глюкозиды и олигосахариды, микроорганизмы используют глюкозу как источник углерода и энергии. У животных и растений β-глюкозидазы выполняют регуляторные функции. В природных источниках β-глюкозидазы встречаются как внеклеточные, так и внутриклеточные, связанные с клетками. β-глюкозидазы преимущественно индуцибельные ферменты. Молекулярная масса β-глюкозидаз находится в пределах от 16 до 500 кДа, при этом почти половина имеет молекулярную массу 50-200 кДа.

Экзоглюкогидролазы или 1,4-β-глюкан-глюкогидролаза (КФ 3.2.1.74) отщепляют глюкозу от невосстанавливающего конца целлюлозной молекулы. Очень медленно гидролизует целлобиозу.

Расщепление полимерных субстратов клеточной стенки растений происходит при совместном действии различных типов ферментов. Так, эндоглюканазы расщепляют цепи целлюлозы в основном посередине, образуя в большом количестве невосстанавливающие концы, от которых целлобиогидролазы и экоглюкогидролазы отщепляют молекулы целлобиозы и глюкозы. Образующуюся целлобиозу целлобиазы расщепляют до глюкозы.

Характерно, что продуценты целлюлаз синтезируют множественные формы однотипных ферментов (эндоглюканаз, экзоглюканаз, целлобиаз), которые неодинаково действуют на разные типы целлюлоз, образуя те или иные продукты. Конфигурация ано-мерного гидроксила у продуктов реакции зависит от типа фермента, действующего на субстрат. Так, β-конфигурация ОН-групп у С-1 продукта реакции сохраняется при действии на субстрат эндоглюканаз и β-глюкозидаз. При действии на субстрат целло-биогидролаз происходит стереоспецифический процесс — аномерный гидроксил инвертируется целлобиогидролазой II, а целлобиогидролаза I сохраняет β-конфигурацию.

Целлюлолитические ферменты способны катализировать реакции трансгликозилирования. Трансгликозилирование — это перенос ферментом фрагмента углеводного субстрата с активного центра на подходящий акцептор, которым могут быть другая молекула субстрата, ее фрагмент, различные спирты. В результате могут образовываться продукты со степенью полимеризации большей, чем у исходного субстрата.

Экзоглюканазы наиболее упорядоченно действуют на полимерный субстрат и обычно образуют единственный низкомолекулярный продукт (например, целлобиоза для целлобиогидролаз). Эндоглюканазы, напротив, образуют несколько низкомолекулярных продуктов в различных соотношениях.

У некоторых грибов, осуществляющих сопряженную деградацию целлюлозы и лигнина, помимо целлюлолитических ферментов обнаружены окислительно-восстановительные ферменты, которые могут принимать участие в деградации высокоупорядоченных форм целлюлозы: это целлобиозооксидаза и целло-биозохиноноксидоредуктаза. Они окисляют целлоолигосахариды до целлобионолактона или после его омыления до целлобионовой кислоты. Целлобиозооксидаза использует в качестве акцептора электронов кислород, восстанавливая его до H₂О₂. Целло-биозохиноноксидоредуктаза окисляет целлюлозу хиноном, продуктом деградации лигнина, восстанавливая его до фенола.

Известны целлюлазы, связанные с клетками, и каталитически активные внеклеточные целлюлазы. Целлюлазы микроскопических грибов являются секретируемыми ферментами, гидролизующими целлюлозу вне клетки. β-Глюкозидаза локализована внутри клетки. Ее субстрат может поступать из внешней среды и разлагаться в клетке. У грибов число определяемых целлюлолитических белков исчисляется десятками, из них большинство является множественными формами основных компонентов. Так, в составе наиболее изученных комплексов грибов Trichoderma reesei, Humicola insolens 7 компонентов, в том числе две целлобиогидролазы и пять эндоглюканаз. Кроме того, в целлюлолитической системе грибов обнаружены ксиланазы и маннаназы. Общее число генов, отвечающих за процесс разложения растительного субстрата, индуцируемых целлюлозой, целлобиозой, лактозой, софорозой и репрессируемых глюкозой, составляет более полутора десятков, при этом они расположены по разным хромосомам гриба.

В целлюлазных системах грамположительной бактерии Cellulomonas fimi, актиномицета Thermomonospora fusca отсутствуют характерные для грибов целлобиогидролаза I и эдоглюканаза I. У Cellulomonas fimi, Thermomonospora fusca имеются ферменты, специфичные к невосстанавливающему концу субстрата. Еще менее сходную с грибами целлюлолитическую систему имеет бактерия Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa. В нее входят три эндоглюканазы, целлодекстриназа, пять ксиланаз, четыре маннаназы, в дополнение к широкому спектру ферментов, отщепляющих боковые группы в гемицеллюлозах. Ферментные системы бацилл и фитопатогенных бактерий рода Erwinia еще более удалены от грибных, у них не обнаружены целлобиогидролазы.

Анаэробные бактерии Clostridium thermocellum разлагают целлюлозу с помощью сложноорганизованных высокомолекулярных внеклеточных структур — целлюлосом. Целлюлосомы обнаружены на поверхности клеток Clostridium thermocellum и обычно содержат от 15 до 25 различных целлюлаз и гемицеллюлаз, объединяемых некаталитическим белком A (Cip А), получившим название скаффолдина. Скаффоддин содержит необходимые структурные фрагменты для сборки целлюлосом, ее фиксации на поверхности клетки и прикрепления к целлюлозному субстрату. Среди ферментов целлюлосом обнаружены как эндоглюканазы так и целлобиогидролазы. При контакте с целлюлозными мицеллами целлюлосомы образуют волокнистую объемную сеть, заполняющую пространство между стенкой бактериальной клетки и целлюлозной мицеллой. Сродство целлюлаз к субстрату обеспечивает адгезию на поверхности целлюлозы в процессе гидролиза. Гидролиз целлюлозы с участием ферментов, ассоциированных в целлюлосомы, происходит эффективно, так как ассоциированные ферменты более активны, чем растворенные ферменты. Примером действия ассоциированных бактериальных целлюлаз является гидролиз целлюлозы, имеющий место в рубце жвачных животных. В гидролизе целлюлозы участвуют различные бактерии, населяющие рубец. Около 5% целлюлаз рубцовой жидкости находятся в свободном состоянии, остальная часть представлена ассоциатами. Целлюлоза в рубце разлагается на 50% за 6-8 час.

Многообразие типов аминокислотных последовательностей, характерное для ферментов, классифицированных прежде под одним номером, наличие у одного организма разнообразных целлюлаз привели к необходимости введения их новых классификационных обозначений.Ферменты, катализирующие превращения растительных субстратов обозначают трехбуквенным сокращением (Cel, Xyn, Man, Lic, Lam).

Обозначать гликозилгидролазы трехбуквенным сокращением не делая при этом различий между экзо- и эндогидролазами предложили Хенриссат с соавторами (1998). В обозначение фермента вводится номер семейства, к которому принадлежит его каталитический домен (КД). По номеру определяют характер действия фермента при гидролизе гликозидной связи. Если каталитических доменов два или более, они указываются в обозначении через тире, начиная с N-конца полипептидной цепи. Последняя буква в краткой форме записи означает порядок открытия домена данного семейства у данного организма. Например, если у Clostridium thermocellum, обозначаемой как Ct, пять разных целлюлаз имеют каталитические домены семейства 5, то фермент, последовательность которого была идентифицирована первой, обозначается как CtCel5A, второй - как CtCel5B и т.д.

В таблице5 приведены примерыновой номенклатуры гликозилгидролазTrichoderma reesei.

Однако эти обозначения субъективны и ряд исследователей полагают, что неопределенность в обозначении ферментов одного организма, принадлежащих к одному семейству, уменьшилась бы, если бы за основу принимался не приоритет в открытии той или иной формы, а такие объективные физико-химические характеристики фермента как его молекулярная масса, изоэлектрическая точка или одновременно оба показателя. Это значительно облегчило бы соотнесение прежних, устоявшихся наименований ферментов с новыми. Новые ферменты даже у хорошо изученных организмов обнаруживают, чуть ли не ежегодно и неопределенность была бы значительно меньше, если указывать принадлежность открываемого фермента. Например, фермент родительского штамма обозначать (n – native), рекомбинантного организма (r – recombinant), а если рассчитан по нуклеотидной последовательности -(c – calculated).

Таблица 5

Примеры новой номенклатуры гликозилгидролаз Trichoderma reesei

(по Henrissat et al., 1998)

Организм и его сокращенное обозначение	Фермент	КФ 3.2.1	Прежнее Сокращение	Новое Сокращение	Примеры записи модульной структуры
Trichoderma reesei (Tr)	Целлобиогидролаза I -“- II Эндоглюканаза I -“- II -“- III -“- IV -“- V		CBHI CBHII EGI EGII EGIII EGIV EGV	Cel7A Cel6A Cel7B Cel5A Cel12A Cel61A Cel45	CD7/CBD1 CBD1/CD6 CD7/CBD1 CBD1/CD5 CD12 CD61/CBD1 CBD1/CD45

На взгляд отечественных исследователей в основе построения номенклатуры должно быть и указание типа действия каталитического домена фермента – целлобиогидролазного (с), эндоглюканазного (е) или смешанного (се), а также обозначены типы ферментов со смешанной целлюлазно-ксиланазной специфичностью (сх или ех). Такая характеристика облегчает идентификацию ферментов на основании их субстратной специфичности.

В связи с тем, что один и тот же организм способен образовывать несколько типов целлюлолитических ферментов, являющихся в большинстве своем мультидоменными белками, домены которых принадлежат к различным семействам, в начале 90-х годов прошлого столетия была предложена классификация целлюлаз по структурным признакам каталитического домена (КД) на основе анализа распределения гидрофобных кластеров по полипептидной цепи.