Схема определения биологической доступности включает пять последовательных этапов исследований.

Первым этапом в исследованиях при определении БД является введение лекарственного вещества в лекарственной форме, при изготовлении которой использовались различные фармацевтические факторы. На данном этапе обязательным требованием является равноценность условий введения препарата всей группе испытуемых (одинаковая масса, пол животного, режим питания и содержания).

Второй этап исследований предусматривает последовательный забор проб биологических жидкостей организма в течение строго обусловленного периода времени. На данном этапе исследований большое значение имеют время и частота забора проб. Общепринято проводить забор проб крови для определения концентрации препарата в течение времени, равного 5 периодам полусуществования вещества в организме. Период полусуществования лекарственного средства в организме – время, в течение которого концентрация лекарственного вещества в плазме крови уменьшается на 50%.

Начало забора проб и частота зависит от вида лекарственной формы и пути введения. При внутривенном введении взятие проб крови начинают по истечении 5 минут после инъекции и далее, продолжают заборы проб крови через 10-15 минутные интервалы времени. В этом случае БД препарата является наиболее полной практически 100%. При других способах введения препаратов необходимо установление времени достижения пика концентрации. Для точного построения кривой фармакокинетики определение концентрации препарата в крови также должно проводиться через небольшие промежутки времени.

Необходимо получить, по крайней мере, три значения до достижения пика концентрации и 5-6 точек на нисходящей части фармакокинетической кривой после начала снижения концентрации лекарственного вещества в крови. Как правило, при однократном введении препарата достаточно 12-16 анализов крови за время эксперимента.

Метод определения БД по экскреции лекарственного вещества с мочой предусматривает выполнение ряда условий:

• выделение хотя бы части препарата в неизменном виде;

• полное и тщательное опорожнение мочевого пузыря при каждом заборе проб;

• строго обоснованная частота забора проб, чтобы точно отметить время задержки экскреции препарата и пик концентрации.

При однократном назначении лекарственного препарата время сбора мочи равняется 7-10 периодам биологического полусущecтвoвaния лекарственного средства в организме, т.к. именно за этот период успевает элиминировать из организма 99,9% введенного лекарственного вещества.

Недостатками метода определения БД на основании данных экскреции препарата с мочой является возможная потеря образца мочи и необходимость принятия испытуемыми большою количества жидкости: 400 мл воды за 1-2 часа до начала эксперимента и по 200 мл воды каждый час в течение всех исследований.

В отдельных случаях для определения БД используют метод многократного назначения препарата. В данном случае необходимо соблюдать следующие условия:

1. Определение БД проводится только после достижения стабильной концентрации препарата в крови, что наблюдается после приема 5-10 доз.

2. Обоснованные интервалы назначения препарата с учетом периода его биологического полусуществования во избежание кумуляции.

3. Частота взятия проб для анализа должна обеспечивать четкую границу пиков концентрации.

4. Точное определение минимальной и максимальной во времени концентрации препарата.

Положительными сторонами метода многократного назначения препарата являются:

• сравнительно высокое содержание препарата в крови, что облегчает проведение аналитических операций и повышает точность определения;

• ограниченность числа взятия проб крови.

Вместе с тем, для правильного определения биологической доступности важное значение имеет физиологическое состояние пациента.

В отдельных случаях следует определять БД препарата у лиц с различными патологическими состояниями:

- с почечной недостаточностью, если лекарственные вещества выводятся через ночки;

- с печеночной, если лекарственные вещества подвергаются метаболизму и метаболиты являются фармакологически активными;

- с поражениями и дисфункциями желудочно-кишечного тракта и др.

Третьим этапом определения БД является определение и расчет концентрации препарата в биожидкости. Определение концентрации лекарственного вещества в пробе биожидкости осуществляют различными химическими или физико-химическими методами. В расчетах используют поправочные коэффициенты, т.к. в биожидкостях лекарственное вещество связано в комплексы с другими эндогенными веществами организма, от которых в процессе анализа стараются избавиться.

На четвертом этапе полученные результаты эксперимента подвергают статистической обработке. Составляют таблицы полученных данных и строят графики, отображающие кинетику того или иного препарата в организме (Рис.1).

Пятый этап исследований включает анализ полученных показателей и обоснование выводов эксперимента.

Степень абсорбции препарата и время появления его в биожидкостях и характеризуются суммой следующих показателей:

1. Площадью под кривой на графике, регистрирующей транспорт лекарственного вещества в организме (AUC).

2. Максимальным пиком концентрации лекарственного вещества в биожидкости Сt.

3. Временем достижения максимальной пиковой концентрации (t).

Один из основных показателей – площадь на графике под кривой, отображающей кинетику диффузии. Площадь под фармакокинетической кривой AUC обозначает общее содержание лекарственного вещества в биожидкости макроорганизма за все время исследования, но не отражает скорости его поступления последовательно, не служит выражением биологической или терапевтической эквивалентности.

Рис. 1. Гипотетические кривые, отражающие содержание лекарственного вещества в крови после назначения его в равных дозах в виде трех

идентичных пероральных лекарственных форм, различающихся методом изготовления [А.И. Тенцова, 1974 г.],

где МЭК – минимальная эффективная концентрация веществ в крови, МТК– минимальная токсическая концентрация веществ в крови;

CtI – «пик» концентрации веществ после назначения в I лекарственной форме,

С t II – «пик» концентрации вещества после назначения во II лекарственной форме,

С t III – «пик» концентрации вещества после назначения в III лекарственной форме,

t I – время достижения «пика» концентрации после назначения в I лекарственной форме,

t II – время достижения «пика» концентрации после назначения препарата во II лекарственной форме,

t III – время достижения «пика» концентрации после назначения в III лекарственной форме;

I, II, III – кривые концентрации вещества, назначенного в I, II, III лекарственных формах соответственно.

На рис. 1 видно, что площади под кривой одного и того же лекарственного вещества, назначенного в виде различных пероральных лекарственных форм (AUC I, AUC II, AUC III) равны, однако при анализе фармакокинетических кривых отчетливо видна неэквивалентность лекарственных форм. Препарат II не обеспечивает минимальной эффективной концентрации, необходимой для лечебного действия. При назначении лекарственного препарата в форме I превышена величина минимальной токсической концентрации и уровень терапевтических концентраций. Время достижения максимальной пиковой концентрации также варьирует в значительной степени.

Наиболее трудным и ответственным при определении биологической доступности является принятие решения о биологической эквивалентности лекарственных препаратов. Общепризнанным считается, что препараты являются биоэквивалентными, если разница в БД не превышает 25%.

Закон Доста

Теоретической основой закона Доста является наличие пропорциональной связи между количеством лекарственного вещества, достигшим большого круга кровообращения и интегралом функции, описывающей временную зависимость концентрации лекарственного вещества в крови.

Следствие закона Доста гласит, что в тех случаях, когда полный анализ фармакокинетических параметров провести трудно, степень БД лекарственного средства может быть установлена по величине отношения площадей (AUC) под фармакокинетическими кривыми, полученными при введении лекарственного средства в изучаемой – R и стандартной – S лекарственных формах.

В данном случае определение степени БД проводят по следующей формуле

БД =

БД – степень биологической доступности;

AUC_R – площадь под фармакокинетической кривой исследуемой лекарственной формы;

AUC_S – площадь под фармакокинетической кривой стандартной лекарственной формы;

доза_R – доза лекарственного средства в исследуемой лекарственной форме;

доза _S – доза лекарственного средства в стандартной лекарственной форме.

Первое слагаемое этой суммы может быть найдено планиметрически, например, методом трапеции, предусматривающим аппроксимацию отдельных участков фармакокинетической кривой отрезками прямых. Для расчета площади под фармакокинетической кривой методом трапеции строят в прямоугольной системе координат график зависимости изменения концентрации препарата в биологической жидкости от времени введения лекарственного средства. Площадь, образованную осями ординат, абсцисс и полученной кривой фармакокинетики, разбивает на n-число прямолинейных трапеций, заменив каждую дугу кривой хордой, которая соединяет конечные точки участков прямой линией (рис. 2).

Рис. 2. Разбивка фармакокинетической кривой на трапеции

[А.И. Тенцова, 1974 г.]

Расчет проводит по формуле

AUC – площадь под фармакокинетической кривой для времени от 0 до t„ час;

h – расстояние на оси абсцисс между сторонами отдельных трапеций;

Y₀, Y_n, Y_n_-1,– высота (по оси ординат) соответственно начальной, конечной и предпоследней сторон трапеции;

Y₁, Y ₂ – высота сторон отдельной трапеции.

Ct_n – концентрация лекарственного вещества в последней пробе;

Kcl – константа скорости элиминации;

Ка – константа скорости всасывания.

Пример расчета биологической доступности

с использованием закона Доста

Расчет биологической доступности с использованием закона Доста можно проиллюстрировать экспериментально по сравнительной биофармацевтической оценке 10% мази стрептоцида и суппозиториев со стрептоцидом на полиэтиленоксидной основе. Опыт проводили на 2 группах кроликах: одной группе вводили свечи, второй – на освобожденный от шерсти участок кожи размером 5х5 см в нижней части спины наносили мазь из расчета 0,5 г/кг. Мазь втирали шпателем. Забор крови из ушной вены производили через 0,5; 1,0; 2 часа после нанесения мази или введения суппозитория. Количественное определение стрептоцида в крови проводили фотоколориметрическим методом после гемолиза и отделения белков. Результаты представлены в таблице 2 и на рис. 3.

Таблица 2