Поли(А)-полимераза Е. сoli

Данный фермент, открытый А.Сиппелом в 1973 г., катализирует присоединение к свободному З’-ОН-концу одноцепочечных молекул РНК поли(А)-последовательностей (рис. 3).

Поли(А)-полимераза находит применение при подготовке молекул РНК к копированию с них комплементарных ДНК. Этот фермент можно использовать и для введения радиоактивной метки в 3’-конец РНК.

Кроме рассмотренных выше, в экспериментах по клонированию фрагментов ДНК и анализу структуры гибридных ДНК используют большой набор других ферментов нуклеинового обмена. К ним относятся полинуклеотидкиназа, щелочная фосфатаза, 5’-экзонуклеаза фага λ, экзонуклеаза IIIЕ. coli, рибонуклеазы, метилазы и др.

Все используемые при конструировании гибридных молекул ДНК ферменты должны быть высокоочищенными, так как даже незначительные посторонние нуклеазные загрязнения могут приводить к побочным реакциям и резко снижать эффективность получения целевых генетических конструкций. Поэтому изучение ферментов, разработка методов их глубокой очистки, а также поиск новых ферментов, специфически действующих на нуклеиновые кислоты, активно продолжаются. В совокупности многочисленные ферменты, имеющие в качестве субстрата катализируемых ими реакций нуклеиновые кислоты, со­ставляют биохимическую базу экспериментов по конструированию in vitro и анализу гибридных молекул ДНК.

5) Методы конструирования гибридных молекул ДНК in vitro

Коннекторный метод

В 1972 г. П.Берг с сотрудниками впервые сообщили о полученииin vitro гибридной молекулы, состоящей из ДНК вируса SV40 и ДНК фага λdvgal. При этом использовался метод, получивший название коннекторного. Принцип одного из вариантов этого метода заключается в следующем. К 3’-концам одного из рекомбинируемыхin vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достраивают одноцепочечные олиго(dА)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента – олиго(dТ)-сегменты примерно такой же длины. При смешении полученных таким образом фрагментов формируются кольцевые структуры за счет водородных связей между олиго(dА)- и олиго(dТ)-последовательностями. Одноцепочечные бреши гибридных молекул ДНК застраивают с помощью ДНК-полимеразы I Е. coli и цепи ковалентно сшивают в лигазной реакции.

Коннекторным методом удается рекомбинировать in vitro фрагменты ДНК, полученные любым из способов расщепления исходной ДНК (механическим, ферментативным). При этом используют синтетические комплементарные олиго(dA)·олиго(dT)- или олиго(dG)·олиго(dС)-концы. Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно используют коннекторный метод.